葉綠體atpB-rbcL序列分析在核果類果樹系統發育研究的應用

摘要：為重建核果類果樹的系統發育，選擇桃、李、梅、杏、櫻桃各4～5個主要種或變種，共24個基因型，測定了其葉綠體非編碼區atpB-rbcL序列。以桂櫻為外種群，用PAuP軟件計算數據集的得分，Modeltest篩選最佳模型和參數，Mega計算遺傳距離、變異，最大簡約法構建系統發育樹。結果表明，1)atpB-rbcL在核果類果樹各組間分子進化速率不同，差異公布不均衡；2)櫻桃較其他核果類果樹原始；李、梅、杏親緣關系較近，梅、杏關系最近。核果類果樹是一個單系群，由一個共同的祖先沿著2個方向進化，一枝進化為櫻桃，另一枝沿不同的途徑產生桃、李、梅、杏等核果類果樹。

關鍵詞：核果類果樹；系統發育；atpB-rbcL；分子進化

中圖分類號：S662 文獻標識碼：A 文章編號：1009 9980(2010)02-213-08

薔薇科(Rosaceae)李亞科(prunoideae)植物約有200個種，從寒溫帶到亞熱帶都有野生種和栽培種的分布，特別是作為果品食用的李、桃、杏、梅、櫻桃等核果類果樹，分布較廣，經濟效益顯著。由于親緣關系較近，核果類果樹間多可自然雜交，這為園藝新品種的培育與利用提供了廣闊的前景和可能，但這也為核果類果樹間的分類和系統發育研究帶來了極大的網難，被美國學者稱為果樹界最大的難題(Hardest Puzzle)。核果類果樹在生產中具有顯著的經濟意義，搞清楚核果類間的分類和系統發育問題具有十分重要的意義。國內外不少學者進行了深入的研究，取得了一定的成果，但到目前為止仍然存在一些爭議，比如櫻桃在核果類果樹系統發育過程中的位置、梅的起源等。

由于葉綠體基因組較小、單親遺傳、不參加基因重組(即不受選擇壓力)，且不受基因的重疊、缺失及假基因的干擾，有獨立的進化路線，不依賴于其他任何數據即可構建分子系統樹、查明植物的進化歷史，因此，葉綠體基因組逐漸成為分子進化和分子系統學研究的焦點。其分子水平上的差異明顯，為比較進化研究提供了基本的信息支持，同時編碼區和非編碼區序列進化速率相差較大，適于不同分類階元的系統發育研究。葉綠體atpB-rbcL區間位于ATP合酶β亞基(atpB)基因和磷酸核酮糖羧化酶大亞基(rbcL)基因之間，有相對較多的信息位點，已被廣泛應用于苔蘚、球蘭、骨碎補科、蓼科、常綠植物、角果木等植物系統發育的研究，并且這個非編碼區在維管植物中的功能(rbcL的啟動子)也有了很好的證明，但核果類果樹中尚未見報道。

我們采用5類核果類果樹各4～5個基因型，采用atpB-rbcL序列測序方法，來分析其序列進化規律及核果類果樹的親緣關系，為構建系統發育樹提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料

采集桃、李、梅、杏、櫻桃早春幼嫩的春梢新葉，用硅膠干燥法保存。樣品名稱、采集地點及類型詳見表1。

1．2 DNA提取

采用改進CTAB法提取硅膠干燥葉的DNA。

1．3 PCR擴增、測序

用Chiang1998年公布的引物來擴增葉綠體atpB-rbcL基因間隔區序列，正向引物：atpB：5’-ACATC-KARTACKGGACCAATAA-3’，反向引物：rbcL-l：5’-AACACCAGCT TrRAATCCAA-3′。該引物同樣用于PCR產物的直接測序。擴增體系為50μL，含HS r Taq(5U·μL^-1)(大連寶生)0.25μL，10xPCR緩沖液(Mg²⁺free)5μL，MgCl₂(25mmol·L^-1)3μL，dNTP混合物(各2.5mmol·L^-1)4μL，引物(10μmol·L^-1)各2μL，模板DNA(10ng·L^-1)2μL，ddH₂O補足至總體積50μL。

PCR擴增在PTC-100TM PCR儀上進行。反應程序為：94℃預變性5min；94℃30s，44℃30s，72℃1min，35個循環；72℃延伸5min。取PCR產物5μL，加入2μL6×溴酚藍上樣緩沖液，于1％瓊脂糖膠電泳，用上海復日科技FR-200紫外與可見分析裝置拍照分析。

選取產生單一條帶，條帶清晰的產物，送上海英俊公司進行PCR直接測序。

1．4 序列分析

在進行數據分析前將測得的序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行Blast相似性搜索，以確保得到的序列為目標序列。加入大葉桂櫻(AB111650)序列，作為分析時的外群，用Clustal X 1.8對序列片段進行比對對齊，變異的位點通過測序圖進行確認，并進行適當的人工調整。用PAUP 4.068計算數據集得分，Modeltest3.7 Windows版本篩選最佳核酸替代模型和參數，運用分析軟件Mega 3.1分析序列的堿基組成，計算遺傳距離，Adequin 2.000進行分子方差分析。用MEGA最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)構建系統進化樹，缺隙(gap)設為缺失狀態，同時以自展法(Bootstrap)進行檢驗，重復1000次。

2 結果與分析

2．1 PCR結果

采用葉綠體atpB-rbcL通用引物，24個核果類果樹基因型在850bp附近均產生了特異擴增(圖1)。說明植物葉綠體基因是十分保守的。

2．2 序列長度和堿基差異

各基因型的特異擴增直接進行PCR測序，桃atpB-rbcL區間大小為867～891bp，杏870～885bp，李877～894 bp，梅873～889bp，櫻桃882～899bp。序列長度差異不大，最大為桃(24bp)，次之為櫻桃(17bp)、李(17bp)、梅(16bp)，杏(15bp)最小(表2)。加入大葉桂櫻(AB1111650，723bp)作為外種群，經比對長度為736bp。GC含量整體都較低，樹種間差異不大，最小為28.4％，最大為29.1％。

序列堿基發生變異的位點為22個，其中簡約信息位點9個，單核酸多態(SNP)13個，插入13個，缺失26個。轉換和顛換的比值為1。

2．3 分子方差分析及變異分布分析

用Arlequin 2.000軟件進行分子方差分析(AMOVA)，桃、李、梅、杏、櫻桃構成核果類種群，大葉桂櫻構成外種群。分析結果(表3)表明，方差變量的77.40％來源于種群間，說明大葉桂櫻與核果類果樹間差異較大。方差變量的9.50％來源于群體內樹種間，13.10％來源于樹種內，樹種內變異是種群內樹種間變異的1.38倍(13.10/9.50=1.38)。說明在核果類進化過程中樹種內部又進行了充分的進化。

同時變異的分布并不平衡，從序列中變異位置(圖2)可以看出，區間1～70、79～205bp、451～520bp等為高度保守區，核果類果樹間完全相同。310～364bp、521～588bp、630～677bp等區間為高度變異區，其變異數分別為6個、6個和5個，共17個，占總變異數的68％(17/25)。堿基變異為17個，前半段5個，后半段12個。序列插入/缺失共8個，前半段(1～368bp)有5個，后半段3個。可見插入，刪除和堿基變異的發生有一定的不均衡性。

2．4 遺傳距離分析

用PAUP對數據集適用模型進行評分，用Mod-eltest3.7 Windows版本進行最佳模型和參數的篩選。最佳模型為K81uf+I：unequal-frequency Kimura 3-paramete。用Mega進行遺傳距離計算(表4)。組平均遺傳距離梅、櫻桃最大，次之為桃、杏，李最小，總遺傳距離為0.004。樹種間序列平均差異為0.001，差異共顯性為0.318。說明核果類果樹間親緣關系較近序列差異較小。組間平均遺傳距離李和杏之間最小(0.002)，而桃和梅、桃和櫻桃、梅和櫻桃之間最大(0.006)。說明櫻桃與其他核果類果樹間親緣關系較遠。

2．5 系統發育樹的構建

大葉桂櫻置根，用最大簡約法構建系統發育樹(圖3)。一致性指數(CI)和維持性指數(RI)較大，分別為0.957和0.960，說明異形同源現象較少，拓撲結構穩定。一共搜索到最大簡約樹310株，樹長為23。小櫻桃(中國櫻桃)與紅燈(歐洲甜櫻桃)、馬哈利櫻桃親緣關系較近，以50％的支持度首先聚在一起(Clade I)，位于系統發育樹的基部，再與其他核果類果樹(Clade II)以50％的支持度聚在一起。而毛把酸與櫻桃并沒有聚在一起。在系統進化樹中櫻桃較早地離開了進化樹，說明櫻桃較其他核果類果樹原始。杏中的藏杏、西伯利亞杏、遼杏和長農17(梅)與所有的李基因型以100％的支持度聚在一起(Clade B)。這個進化枝辨率較低，支持度弱，是因為在這9個基因型的序列中僅有一個堿基的差異。這說明李、梅、杏的關系較近，可能是由同一個祖先不同演化途徑的結果。桃在系統發育樹中的位置相對獨立，未與其他樹種混雜在一起。華光、喀什李光、甘肅桃和山桃、陜甘山桃分別以100％的支持度聚在一起。刺梅1、四川黃梅和甲州小梅、品字梅分別以100％的支持度聚在一起，再與杏中駱駝黃、李光杏以69％的支持度聚在一起(Clade A)。這一進化枝進一步說明梅和杏具有較近的親緣關系。

3 討論

3．1 atpB-rbcL序列的分子進化

作為植物體三大遺傳系統之一，葉綠體DNA較為保守，其進化速率僅為核DNA的1/5(進化速率平均每年每個位點約為0.2～1.0×104)。而基因間隔區(Inter-Gene Sequences，IGS)，由于對功能無影響(或影響小)，相對基因區域具有較大進化率。核果類果樹atpB-rbcL序列平均變異率為22/736=0.0299。不同核果類果樹其變異率有顯著不同，變異位點數櫻桃6個，桃4個，杏3個，李1個，梅5個。

3．2 核果類果樹進化分析

櫻桃和其他核果類果樹的系統發育關系共有3種觀點：第1種觀點認為櫻桃先于李，即櫻桃→李→杏(→梅)→桃。第2種觀點認為李先于櫻桃，即李→櫻桃→杏(→梅)→桃。第3種觀點認為甜櫻桃和中國櫻桃分別屬于李和杏2個進化枝上。本研究中櫻桃較早離開進化枝，聚在其他核果類果樹的外側，支持第1種觀點，與劉艷玲等、Bor-tiri等的研究結果一致。櫻桃組雖然聚在一起，但個體間形態性狀差異較大(特別是腋芽單生或并生、花序形狀、著花數等)、地理分布范圍較廣，導致其種間聚在一起的內部支持率較低。同樣的道理，另一分枝支持率也較低。值得注意的是毛把酸并沒有與其他櫻桃聚在一起，而是與其他核果類果樹聚在一起。酸櫻桃起源于西亞，自古栽培，有許多變種和變型。毛把酸屬于歐洲酸櫻桃的一種，可能與起源于中國的核果類果樹關系較近，因而在系統發育樹上聚在一起。進化枝Ⅰ和進化枝Ⅱ與劉艷玲等系統發育樹結構一致，可初步推論：核果類果樹是一個單系群，由著一個共同的祖先沿著兩個方向進化，一枝進化為櫻桃，另一枝產生桃、李、梅、杏等核果類果樹。

系統發育樹中刺梅1、四川黃梅和甲州小梅、品字梅分別以100％的支持度聚在一起再與杏中駱駝黃、李光杏以69％的支持度聚在一起(Clade A)，這與梅、杏具有較近的親緣關系的結論一致。梅和杏較近的親緣關系，此前也得到了形態學、細胞學、分子標記、序列分析等方面證據支持。

本研究中西伯利亞杏、遼杏首先聚在一起，再與藏杏、長農17(梅)一起與李以100％的支持率聚在一起(Clade B)。這一分枝得到較強的支持，表明李杏和梅親緣關系較近的結論。而汪祖華等通過李、杏、梅供試品種進行過氧化物酶同工酶分析，發現這3個種群存在較為一致的特征酶帶，其譜型間差異甚小。而它們與桃、櫻桃種群則差異顯著，除核果類2條特征酶帶P1(0.11)、P2(0.19)外，其余各帶均不一致。可以推測：李、杏、梅的基因型比較相似，親緣關系比較相近。張俊衛等通過對梅、桃、李、杏、櫻的RAPD分析，認為梅的基因中滲入了較多的杏、李基因，聚類分析的結果也表明李、杏在梅的系統發育過程中處于基本等同的地位，桃、櫻與梅的親緣關系則相隔較遠。

桃組在系統發育樹中的位置相對獨立，華光、喀什李光、甘肅桃和山桃、陜甘山桃分別以100％的支持度聚在一起。陜甘山桃是山桃的一個變種，親緣關系較近，以高支持度聚在一起。山桃分枝與另一分枝差異相對較大，從形態學上看，山桃和陜甘山桃為野生、叢狀灌木，果實不可食，而另一分枝為喬木，果實可食。普通桃、新疆桃關系較近，與山桃關系較遠，這一結論也得到了其他數據的支持。

通過本研究，進一步明確了核果類果樹atpB-rbcL序列的分子進化規律及系統發育關系，對此前相關研究是一個有益的補充。葉綠體序列分析作為一種新穎高效的研究手段，在果樹親緣關系、分類及系統發育等研究上具有廣闊的應用前景，為果樹系統進化樹的構建提供新的思路。但由于葉綠體序列的高度保守性及采樣的局限性，本研究的系統進化樹精度還不夠高，尚需要采取更多葉綠體序列及更全面的采樣進行深入分析。

4 結論

atpB-rbcL在核果類果樹各組間分子進化速率不同，差異公布不均衡。櫻桃較其他核果類果樹原始。李、梅、杏親緣關系較近，梅、杏關系最近。核果類果樹是一個單系群，由一個共同的祖先沿著兩個方向進化，一枝進化為櫻桃，另一枝沿不同的途徑產生桃、李、梅、杏等核果類果樹。

致謝：感謝國家種質資源圃南京桃圃、云南植物研究所、山東果樹所和遼寧果樹所提供植物材料。