直接涂片法與集菌改良法對(duì)抗酸桿菌檢出率的比較

【摘要】:目的:探討一種簡(jiǎn)單易行、陽性率高的痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢查方法，以達(dá)到在非肺科?？漆t(yī)院中對(duì)肺結(jié)核病患者初篩的更為有效的方法。方法:采用離心沉淀集菌改良法和直接涂片法對(duì)100例隨機(jī)采樣痰標(biāo)本進(jìn)行抗酸染色鏡檢，其中直接涂片法采用酒精燈加熱，集菌涂片法選用水浴箱恒定加熱方式。結(jié)果:直接涂片法抗酸染色陽性率為30%，集菌涂片改良法抗酸染色陽性率為64%(P<0.001)。結(jié)論:集菌涂片改良法陽性檢出率與直接涂片法陽性檢出率相比較有顯著性差異(P<0.001)，且涂片效果清晰，易于辨認(rèn)，故集菌涂片改良法可作為非肺科醫(yī)院結(jié)核病的初篩試驗(yàn)推廣運(yùn)用。

【關(guān)鍵詞】:結(jié)核病;集菌涂片;直接涂片;水浴加熱

【中圖分類號(hào)】R446.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517 (2010) 02-041-3

在綜合性醫(yī)院中，結(jié)核菌的涂片檢查是作為結(jié)核病患者的初篩實(shí)驗(yàn)，是一種快捷、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單的方法，在對(duì)結(jié)核病患者初篩診斷中起著重要的作用。早發(fā)現(xiàn)早治療，對(duì)于患者的康復(fù)也是至關(guān)重要的，現(xiàn)代結(jié)核病控制的基本策略之一就是有效發(fā)現(xiàn)和治愈傳染源。結(jié)核患者的細(xì)菌學(xué)檢查，是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要途徑和手段，是確定結(jié)核診斷和治療方案的重要依據(jù)，也是考核療效、評(píng)價(jià)防治效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)[1]。涂片染色鏡檢是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)菌學(xué)檢查方法，如何提高痰涂片結(jié)核菌檢測(cè)陽性率，使檢測(cè)結(jié)果更具說服力，本文研究方案是將集菌涂片法加熱方式改為恒溫水浴箱加熱，而通常實(shí)驗(yàn)室采用的直接涂片法加熱方式仍為酒精燈加熱，用這兩種不同的檢查方法對(duì)所收集的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片染色鏡檢，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下:

1對(duì)象、材料和方法

1.1對(duì)象:采集2009年5月份貴陽市肺科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌室合格的門診、住院病人痰標(biāo)本100例，標(biāo)本不區(qū)分初診、復(fù)診、性別、年齡和肺科醫(yī)院所檢測(cè)的陰陽性結(jié)果，完全隨機(jī)。

1.2標(biāo)本采集:采取患者清晨深部痰，潔凈水或冷開水漱口后，用力咳嗽以獲得的合格痰液盛裝于蠟盒內(nèi)，用密封容器帶回待檢。

分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時(shí)與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達(dá)到染色目的。

1.3試劑器材:

抗酸染液:四川省邁克科技有限公司生產(chǎn)的抗酸桿菌染液試劑盒

恒溫水浴箱:姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司，420-A型

離心機(jī):上海安享科學(xué)儀器廠，TDL-5-A型

生物安全柜:上海三超凈化設(shè)備有限公司，SCJ-C-1300II/B

光學(xué)顯微鏡:OLYMPUSCX21FS1

氫氧化鈉:重慶北碚化學(xué)試劑廠分析純批號(hào):911114

鹽酸:遵義高等師?；瘜W(xué)試劑廠分析純批號(hào):860708

酒精:95%乙醇

立式壓力蒸汽滅菌器:江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠，LS-B75L型

1.4檢測(cè)方法:(1)新玻片在涂片前在酒精燈火焰上過3次，以達(dá)到脫脂目的，待用;(2)將收集來的痰標(biāo)本先進(jìn)行直接涂片，涂成2cm×2.5cm橢圓形、圓形、均勻，很少有空白區(qū)的厚痰膜三張，待自然干燥;(3)將余下痰液倒入大試管中，加入約2倍體積2%NaOH溶液，加溫，37℃消化30min，期間反復(fù)搖勻，將上述消化后標(biāo)本經(jīng)3000r/min離心30分鐘，棄去上清液，取沉淀涂成2cm×2.5cm橢圓形、圓形、均勻，很少有空白區(qū)的厚痰膜三張，待自然干燥[2];(4)上述自然干燥后的痰片經(jīng)酒精燈火焰固定。

1.5染色步驟:參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第三版標(biāo)準(zhǔn)。其中直接涂片加熱方式采用酒精燈加熱，集菌涂片采用將痰片置于55℃～60℃水浴箱中加熱[3]，使用四川省邁克科技有限公司生產(chǎn)的抗酸桿菌染液試劑盒，按照說明書進(jìn)行抗酸染色，干后鏡檢。

1.6染液質(zhì)量控制:采用卡介苗做抗酸染液陽性對(duì)照;采用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922做抗酸染液陰性對(duì)照。

1.7結(jié)果判斷:參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第三版標(biāo)準(zhǔn)判定。涂片染色后，肉眼觀察痰膜呈淡藍(lán)色或藍(lán)色，不得有紅色斑塊，痰膜脫落部分在10%以下，鏡下所見，視野背景清晰，100×油鏡的視野內(nèi)于淡藍(lán)色背景下，抗酸菌呈紅色桿菌，其他細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)視野(觀察時(shí)間不少于4min)，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌者繼續(xù)觀察至300個(gè)視野，仍未發(fā)現(xiàn)抗酸菌者報(bào)告抗酸菌陰性(-);鏡檢按100-300個(gè)視野找到抗酸桿菌1～2條者，報(bào)告抗酸桿菌可疑(±)，或者重新涂片或另留痰標(biāo)本復(fù)查;鏡檢100個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌3～9條者，報(bào)告抗酸桿菌陽性(1+);鏡檢10個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿均1～9條者，報(bào)告抗酸桿菌陽性(2+);鏡檢每個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌1～9條者，報(bào)告抗酸桿菌陽性(3+);鏡檢每個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌多于9條以上者，報(bào)告抗酸桿菌陽性(4+)為標(biāo)準(zhǔn)，鏡檢各方法染色涂片三張后綜合結(jié)果進(jìn)行記錄、統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):

由上表可知，集菌涂片改良法陽性檢出率顯著高于直接涂片法陽性檢出率(P<0.001)，兩者有顯著性差異。

上表結(jié)果中，集菌涂片法的2+的結(jié)果中，>1+的結(jié)果有6例，4+的結(jié)果中，>4+的結(jié)果有5例

2.2顯微鏡攝影結(jié)果對(duì)比:

3討論

3.1從結(jié)果中可以看出，兩種方法相比較有顯著性差異(P<0.001)，集菌涂片改良法陽性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接涂片法，且從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖片中可看出，在同一份標(biāo)本中，集菌改良法的陽性程度高于直接涂片法，集菌改良法鏡檢結(jié)果大于直接法鏡檢結(jié)果的共有11例，涂片所示，集菌改良法鏡檢顯示抗酸桿菌數(shù)量上有明顯提高。由于NaOH的消化作用，使得集菌法的鏡下顯示背景清晰，與抗酸桿菌的著色有較大反差，更易于辨認(rèn)(如圖示)，減少了漏檢的機(jī)率，增加其陽性檢出率。

本文采用兩種方法檢驗(yàn)的100例痰液標(biāo)本中，集菌改良法64例陽性中，直接涂片法只有30例陽性，其余均為陰性。兩種方法對(duì)100例痰檢陽性結(jié)果相比較，在相同判斷標(biāo)準(zhǔn)下，兩種方法檢出陽性結(jié)果只有30例完全相符合，集菌改良法檢出的64例陽性結(jié)果在直接法中的陽性程度均減少甚至為陰性。

3.2直接涂片法在實(shí)驗(yàn)過程中存在以下幾點(diǎn)問題:①涂片時(shí)厚片與薄片在鏡檢時(shí)，結(jié)果有很大差別;②由于直接法只是挑取痰液進(jìn)行涂片，是否挑至有效部位(菌量較多處、血性、膿性部分)，將對(duì)結(jié)果有很大影響;③由于痰液直接被涂片，致使染色后，鏡下其他細(xì)胞較多，在患者帶菌量較少時(shí)，呈紅色的抗酸桿菌可能會(huì)與藍(lán)色的其他細(xì)胞作為的背景融合，不利于檢驗(yàn)人員對(duì)抗酸桿菌的識(shí)別;④加熱不易控制。以上幾點(diǎn)均會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，但其操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短為其優(yōu)點(diǎn)。而本文所采用的集菌涂片改良法方式有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):①本研究采用的消化液為2%NaOH溶液，該試劑價(jià)格便宜，且消化時(shí)不需進(jìn)行高壓滅菌處理[4]，大幅縮短了該法的實(shí)驗(yàn)耗時(shí);②本研究的方法是針對(duì)所采集患者的全部痰液，即采集到的患者痰液全部進(jìn)行消化處理，消化結(jié)束后經(jīng)3000r/min離心30min處理，使痰液中未被消化的抗酸桿菌充分沉淀;③經(jīng)此處理后的痰液，沉淀下來的菌量較大，因此該法在涂片時(shí)無需區(qū)分厚片與薄片;④經(jīng)消化處理后的痰液液化較充分，除抗酸桿菌外的其他細(xì)菌被消化，使染色后，鏡下所見背景較清晰，易于檢驗(yàn)人員對(duì)抗酸桿菌的識(shí)別(如圖示)，提高了陽性檢出率，有效避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。但此法相對(duì)于直接涂片法操作時(shí)間較長(zhǎng)、步驟較多。

3.3抗酸染色法作為結(jié)核病細(xì)菌診斷的經(jīng)典方法之一沿用至今，但成功染成一張質(zhì)量較好的涂片尚有一定難度，制片影響因素較多。

本研究采用兩種涂片染色法同時(shí)，直接涂片法仍采用酒精燈對(duì)痰片進(jìn)行加熱，而集菌改良法加熱方式選擇為55℃～60℃恒溫水浴箱對(duì)痰片進(jìn)行加熱，該法在使用時(shí)溫度恒定，有助于染液與抗酸桿菌的充分結(jié)合，使菌體著色較為充分，染色效果較好，配以集菌法的天然優(yōu)勢(shì)，使鏡下所示，抗酸桿菌的著色與背景顏色有較大的反差，有利于檢驗(yàn)人員的識(shí)別(如圖示)，而傳統(tǒng)的酒精燈加熱，加熱時(shí)間與溫度很難把握，極易造成加熱時(shí)間過長(zhǎng)、溫度過高、染液干涸等，這些都將導(dǎo)致菌體變性，直接影響在鏡檢時(shí)的效果。

綜上所述，痰液集菌涂片改良法抗酸染色可大幅提高其陽性檢出率，配合水浴箱加熱法，是一種簡(jiǎn)單易行、陽性率高的方法，適合在廣大綜合性醫(yī)院中作為肺結(jié)核患者的初篩試驗(yàn)，對(duì)肺結(jié)核病患者的早日康復(fù)有著重要意義。此外，標(biāo)本質(zhì)量也至關(guān)重要，一份合格的痰標(biāo)本，加之陽性率高的檢查方法，可更進(jìn)一步提高痰液中抗酸桿菌的檢出，因此，在臨床采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)特別注意，這樣才可真正達(dá)到肺結(jié)核患者在非肺科?？漆t(yī)院中的初篩目的。

4結(jié)論

集菌涂片法陽性檢出率與直接涂片法陽性檢出率有顯著性差異(P<0.001)，故集菌涂片改良法可作為非肺科醫(yī)院結(jié)核病的初篩試驗(yàn)。

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