組織工程生物反應器的研究進展

【關鍵詞】:組織工程;生物反應器;研究

【中圖分類號】R318.0【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517 (2010) 02-015-2

組織工程是指用工程科學和生命科學的原理和主法，制備組織和器官替代物，以恢復、維持或改善人體組織、器官的功能，是一個發展迅速、意義深遠的生物醫學工程應用領域。而目前，骨組織是僅次于血液的第二大移植物，正需要與組織工程學結合，解決大量需求的問題。阻礙骨組織工程發展和臨床應用的主要因素至少包括兩點:(1)對調控組織的功能化培養的物理-生物化學因素知之還少;(2)高昂的生產成本和缺乏商業化的功能性組織工程產品。而解決上述問題，組織工程生物反應器的角色至關重要。組織工程生物反應器與細胞規模化擴增，細胞在基質上高密度、均勻化生長，營養物的供給和代謝物的移除等重要物質傳遞過程式，以及對細胞所施加的力學刺激密切相關。它一方面可成為研究組織細胞培養的不同環境因素如何影響特定細胞、組織的三維功能化培養的重要技術手段，另一方面它是改進功能化組織質量、降低生產成本的關鍵之一;同時它也是組織工程從實驗到標準的工業化、規模化生產，到臨訂應用過程中的一個關鍵環節。目前應用于骨組織工程的生物反應器主要有攪拌式生物反應器、灌注式生物反應器和旋轉壁式生物反應器三大類。本文將就以上三種反應器的力學環境、細胞接種和傳質作用綜述如下:

1力學環境

在生理狀態下，骨組織為適應機體活動所需的物理支持而在不斷的改建和塑形，以滿足不同個體對動作或姿勢的特殊需求，當骨組織長期失去正常的力學刺激，骨骼可出現明顯的脫鈣、疏松。在體內，成骨細胞所處的這種力學環境極為復雜，而在體外細胞培養的基礎上力學刺激通常分為壓應力系統、張應力系統、流體剪切應力系統和離心力培養系統。

1.1攪拌式生物反應器

其主要原理是通過葉輪或是漿式攪拌器攪動培養液從而提供傳質能力，為細胞培養提供一定的氧濃度和均勻的養分分布的環境，有利于細胞保持天然形態，并維持其新陳代謝在正常的生理范圍。但由于是通過攪拌，使培養液中的切應力較大，從某種意義上來說這是不適合組織工程式細胞和組織的培養。所以如何減少攪拌時的剪切應力，成為攪拌式生物反應器性能提高的重要環節。而剪切破壞主要原因是氣泡的破裂，故避免大氣泡的產生非常重要。在骨組織工程中，攪拌式生物反應器主要應用于細胞與支架的復合。配合微載體、多孔微球、灌注技術，可達到更好的細胞培養效果。譚昌月等人[1]曾在攪拌式生物反應器中采用Cytoporel多孔微載體和無血清培養基DF5S連續灌流培養CHO工程細胞株4B3來生產重組組織型纖溶酶原激活劑，實現了高密度長期培養4B3細胞，有效地保證了重組組織型纖溶酶原激活劑生產的質量一致性。

1.2灌注式生物反應器

灌注式生物反應器是通過培養液的循環灌注，從而可以對所培養的細胞施加流體剪切力、靜態壓縮力等應力刺激。Glowacki J等[2]發現在體外培養尺寸較大的支架時，應用灌注式生物反應器將培養液灌注到三維多孔支架內部，能夠增強細胞的活性和功能。Goldstein AS等人[3]發現應用灌注式生物反應器以特定流速培養細胞時能夠促進細胞的生長、分化。Gomes ME等人[4]發現應用灌注式培養器可以促進骨髓基質細胞的鈣基質的沉積。但是對于不同空間結構的三維多孔支架，必然要不同的灌注速率，什么樣的速率是最優的、最有利于細胞生長的，有必要使用專業的流體力學分析軟件 (如FLUENT) 來對不同結構的支架進行預先分析和模擬。得到一些比較有價值的數據，可以分析細胞所受剪應力的大小等。

1.3旋轉壁式生物反應器

旋轉壁式生物反應器(rotating wall vessel bioreactor，RWVB)是水平旋轉、 無氣泡的膜擴散式氣體交換的培養系統。細胞通過膜式氣體交換器來吸氧和排出CO2，任何氣泡都會被清除，消除了旋渦對細胞的生長的影響。懸浮細胞和微載體珠粒上的貼壁細胞在水平的旋轉式細胞培養容器內產生一個均勻的、極低剪切力的液體懸浮軌道，隨著細胞的長大，可調節旋轉的速度來抵償沉降速率。由于該系統無推進器、空氣升液器、氣泡或攪拌器，細胞顆粒不與容器壁或任何其它易致傷的物體相碰，故幾乎沒有破壞性的剪切。有別于其它生物反應器，RWVB中培養液的驅動是以其本身的重力及液體與筒壁的相互作用產生。它不同于機械攪拌，氣液推動等傳統驅動模式，較好地減少了機械剪切和氣泡，滿足了組織工程中對細胞的剪切力應充分小的要求，因此RWVB培養細胞更接近自然條件下生長的細胞[5，6，7]。另外，當RWVB水平運轉時，在浮力、離心力、培養液帶動的共同作用下，培養物在RWVB中的特定位置可處于微重力環境，有利于其本身的三維生長，使三維組織成型更加容易。旋轉生物反應器具有低剪應力特征[8，9，10]，可提供非破壞性的低剪應力 (<1162dyn/cm2) ， 減少培養液轉動時對細胞產生的機械損傷。Jessup等研究表明低轉速和低剪切力可以減少細胞的凋亡，促進分化增殖[11]。

2細胞接種

細胞與支架黏附并組織化是組織構建的重要環節和必要條件。研究表明，種子細胞接種的密度及其在支架中的分布對于種子細胞的增殖、分化和遷移產生重要影響，并最終影響組織工程化組織的質量[12，13]。與以往靜態的接種方法相比，動態接種方法能明顯提高種子細胞的接種效率，獲得較高的接種密度和在支架內的均勻分布[14]。近年來，研究者通過不斷改進生物反應器的性能，在改善培養環境的同時，也明顯提高了種子細胞的接種效率。攪拌瓶生物反應器中，種子細胞懸浮于培養液中被不斷攪拌，與支架材料接觸。種子細胞首先黏附于支架材料表面，繼而遷移至支架內部。這種接種方法使種子細胞在支架內分布不均，支架表面種子細胞密度高，而支架內部種子細胞密度卻較低。與攪拌瓶生物反應器中產生的渦流相比，旋轉壁生物反應器所引起的液流方式為層流，這種液流方式在減少流體剪切力的同時，明顯提高了種子細胞的接種密度，并使其在支架內的分布更加均勻。Carrier等[15]在實驗中通過比較，觀察到旋轉壁生物反應器的接種效率比攪拌瓶生物反應器提高23%，而對細胞的損傷卻減少了20%。直接灌注式生物反應器將培養液通過泵加壓方式直接注入支架材料中，使懸浮于培養液中的種子細胞隨液流進入組織塊內部，與靜態接種和攪拌瓶接種相比，不僅接種效率高，在支架內的分布也均勻[16]。

3傳質作用

3.1攪拌式生物反應器

攪拌式生物反應器提高的培養液中的氧濃度，可使培養液中的營養成分均勻分布。Nilsson K等人研究表明，攪拌式生物反應器的培養液營養物質的傳遞明顯優于靜置培養組[17]。但是由于力學因素的作用，使攪拌式生物反應器并不適于組織細胞的培養。

3.2灌注式生物反應器

灌注式生物反應器具有較高的傳質效率，因而增強了細胞的增殖、分化能力和功能表達。Freed LE等[18]認為灌注式生物反應器可確保種子細胞在載體中心的均勻分布，為載體內種子細胞的增殖提供必要的營養物質和氧氣，實現細胞周圍有效的氣液交換。Goldstein等[19]研究表明灌注型生物反應器培養下的細胞復合效率和功能優于轉瓶式和旋壁式生物反應器。然而由于灌注式生物反應器的傳質作用主要是靠分子的滲透作用，目前設計的生物反應器僅適用于數毫米載體的構建，對于超過一定厚度的培養組織，難以進行營養滲透，構建的組織仍不能滿足修復重建大段骨缺損的需要。但應用灌注式生物反應器便于施加其它的力學刺激，從而改善培養液在細胞間的流動[20]。傳質的效率與流量有直接關系，流量又與支架材料的孔隙率及流體的黏度和流速有關。過高的流速雖然增加了流量，但同時產生了過高的流體剪切力，不利于種子細胞的黏附和細胞外基質的沉積。理想的灌注式生物反應器應把握好傳質作用、流體剪切力及細胞和細胞外基質駐留三者之間的平衡[21]。

3.3旋轉壁式生物反應器

由于旋轉壁式生物反應器有很好的物質交換功能，細胞在RCCS 中能以很高的密度生長，其組織的培養密度為1010～1011個細胞/ml，細胞的培養密度為108，故可快速大規模地培養細胞。此外，RCCS是目前唯一能使研究者進行共同培養的生物反應器，而這種培養能提供本能的分化、高細胞增殖、低的細胞死亡率和增加細胞產物的分泌。在懸浮狀態下，細胞營養混合更均勻，細胞生長狀況均一，不會產生局部的副產物積累，因而細胞生長速率快，從而可獲得更多細胞。旋轉壁生物反應器培養的組織塊在生物化學和生物機械性能方面均優于靜態培養和攪拌瓶[22]。

4展望

隨著骨組織工程學研究的深入和發展，生物反應器必然會擁有越來越廣泛的用途，也必然會受到越來越多的重視。而它的發展，反過來也必然會帶動骨組織工程的進一步發展。目前，生物反應器在組織工程中的應用仍主要停留在細胞或組織培養的某個階段。目前存在的生物反應器仍具有以下不足:1、操作繁瑣，易于污染。2、能夠施加的影響因素單一，距體內的環境相去較遠。3、智能化、規模化程度低，難以滿足大量的臨床需求。4、多是單一研究應用，未能形成產業化發展。隨著活體內生物環境的進一步探明、生物仿生學的發展、人工智能的開發，以及工程科學的進步。骨組織工程生物反應器將會進一步實現仿生環境的模擬、智能化的調控、產業化的生產。

參考文獻

[1] 譚昌月.用喃乳動物生產人用治療制劑的發展與改進[J].國外醫學(預防、診斷、治療用生物制品分冊)2001，24.