丙烯菊酯和胺菊酯與DNA相互作用的光譜研究

摘要:采用紫外和熒光光譜法，研究了丙烯菊酯和胺菊酯與單雙鏈DNA、鳥嘌呤及鳥嘌呤核苷之間的相互作用。擬除蟲菊酯農(nóng)藥可使DNA溶液的吸收光譜出現(xiàn)減色效應(yīng)，但最大吸收波長無明顯位移;不同濃度的DNA可導(dǎo)致農(nóng)藥熒光猝滅。還分別考察了離子強度、KI對農(nóng)藥-DNA體系的影響及農(nóng)藥對中性紅-DNA體系的影響。結(jié)果表明:丙烯菊酯與ssDNA之間存在靜電和溝槽兩種作用方式，而胺菊酯與ssDNA之間主要是靜電作用。鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥作用的紫外和熒光光譜研究表明，它們與農(nóng)藥之間主要以氫鍵相互作用，且鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥的作用比鳥嘌呤與農(nóng)藥的作用要強。

關(guān)鍵詞:丙烯菊酯;胺菊酯;DNA;作用方式;光譜法

Studies on the interaction of allethrin and tetramethrin with DNA by spectrometry

Zhaoyang-Wu1，Yin-Liu1，2，Chonglin-Luan2，Xiaohua-Jiang2

(1 State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics ， College of Chemistry and Chemical Engineering ， Hunan Univ ， Changsha ， Hunan 410082， China;

2 Department of Fine Chemical Engineering， Shenzhen Polytechnic， Shenzhen， Guangdong 518055， China)

Abstract: The interaction of allethrin and tetramethrin with single strand DNA (ssDNA)，double strand DNA， guanine and guanosine were studied by UV and fluorescence spectrophotometry. Pyrethroid Pesticide brought about a hypochromic effect on the UV absorption spectrum of DNA， but the maximum absorption wavelength of DNA did not shift obviously; the addition of varied concentration of DNA caused the fluorescence quenching of pesticides. It was investigated that the effect of ionic strength and KI on the system of pesticide-DNA respectively as well as the effect of pesticide on the neutral red-DNA. The results indicated that the electrostatic binding and groove binding are the two major modes of the interaction between allethrin and DNA， while electrostatic binding mainly exists between tetramethrin and DNA. The spectra of UV and fluorescence of Guanine and guanosine interact with pesticides proved that the interaction between them and pesticide is hydrogen bonds chiefly， and guanosine interacts with pesticides stronger than guanine does.

Keywords: allethrin; tetramethrin; DNA; interaction; spectrometry

擬除蟲菊酯是根據(jù)天然菊素化學(xué)結(jié)構(gòu)仿生合成的一種廣譜高效殺蟲劑，是繼有機氯殺蟲劑、有機磷殺蟲劑、氨基甲酸酯殺蟲劑之后的一個新突破[1]， 被廣泛應(yīng)用于蔬菜，水果，糧食，茶葉，煙草等作物的病蟲防治，使用量逐年增加。擬除蟲菊酯農(nóng)藥為神經(jīng)毒物，對魚類、蜜蜂和家蠶的毒性較高[2，3]，也是環(huán)境和人類健康潛在的威脅物[4]。人類長期食用含有殘留擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的食物，容易造成亞慢性或慢性中毒，因此各國越來越重視對該類農(nóng)藥在農(nóng)副產(chǎn)品中殘留的監(jiān)控[5-7]。脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳信息的載體，基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)，所有的標(biāo)靶酶和受體蛋白都是從DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程產(chǎn)生的。研究DNA與小分子農(nóng)藥的相互作用，可以從分子水平上解釋農(nóng)藥與DNA的作用方式和機理，了解農(nóng)藥對DNA的潛在損傷作用，評價和預(yù)測其對人類健康的危險性，并且對利用DNA作為傳感器進行農(nóng)藥監(jiān)測具有重要的指導(dǎo)意義。

光譜法是研究DNA與小分子相互作用的一種最方便，最常見的技術(shù)，常被用于藥物作用機理的研究。氨基甲酸酯類農(nóng)藥(如甲萘威，異丙威等)與DNA之間相互作用的光譜法研究也已有報道[8，9]，但擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在此方面的研究尚未見報道。本文采用紫外光譜和熒光光譜法對第一代擬除蟲菊酯類農(nóng)藥——丙烯菊酯(allethrin)和胺菊酯(tetramethrin)與單雙鏈DNA、單堿基鳥嘌呤、鳥嘌呤核苷的相互作用進行了研究。

圖1 丙烯菊酯和胺菊酯的分子結(jié)構(gòu)

Fig.1 The molecular structures of allethrin and tetramethrin

1實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UV-2450型紫外-可見分光光譜儀(日本島津);PHS-3D型酸度計(上海雷磁儀器廠);F-4600熒光光譜儀(日本，日立公司)。

小牛胸腺DNA(CTDNA)購自sigma公司，生化試劑，OD260/OD280>1.8，用5 mM的Tris-HCl(pH=7.1，含50 mM的NaCl)緩沖液配制成0.1 mg#61655;mL-1的儲備液。單鏈DNA溶液:取已經(jīng)配置好的CTDNA溶液在沸水浴中加熱半小時，迅速放置冰水中冷卻，使其變性得到單鏈DNA(ssDNA)(濃度由260 nm處的吸光度計算，ε= 6600 L#61655;mol-1#61655;cm-1，得到1 μg#61655;mL-1 ssDNA的摩爾濃度為3.2×10-6 mol#61655;L-1)。鳥嘌呤(guanine)和鳥嘌呤核苷(guanosine)購自Amresco，用0.1 mol#61655;L-1的鹽酸分別配制成0.2 mg#61655;mL-1和0.5 mg#61655;mL-1的儲備液。丙烯菊酯，胺菊酯購自sigma公司，分別用無水乙醇配制成1 mg#61655;mL-1的儲備液，避光保存在4℃的冰箱中。pH=6.75的5 mM的Tris-HCl緩沖溶液(含50 mM的NaCl)，其他試劑均為分析純，實驗用水為去離子二次蒸餾水。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1紫外光譜

在一系列10 mL的比色管中分別加入相同量的ssDNA(或單堿基)溶液，改變加入丙烯菊酯(或胺菊酯)的用量，用pH=6.75的5 mM Tris-HCl緩沖溶液(含50 mM的NaCl)定容到5 mL，搖勻，放置半小時，以相應(yīng)濃度的丙烯菊酯(或胺菊酯)溶液為參比，于200-400 nm間測定紫外吸收光譜。

1.2.2熒光光譜

在一系列10 mL的比色管中加入相同量的丙烯菊酯(或胺菊酯)，改變加入ssDNA溶液的量，用pH=6.75的5 mM Tris-HCl緩沖溶液(含50 mM的NaCl)定容到5 mL，搖勻，放置半小時，測定熒光光譜。狹縫寬度Ex=5 nm， Em=5 nm，掃描速度1200 nm#8226;min-1。

在一系列10 mL的比色管中加入相同量的鳥嘌呤或鳥嘌呤核苷溶液，改變加入丙烯菊酯(或胺菊酯)的用量，用pH=6.75的5 mM Tris-HCl緩沖溶液(含50 mM的NaCl)定容到5 mL，搖勻，放置半小時，測定熒光光譜。狹縫寬度Ex=5 nm， Em=5 nm，掃描速度1200 nm#8226;min-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜

2.1.1 丙烯菊酯和胺菊酯與ss-DNA作用紫外光譜

(a)

(b)

圖2 不同濃度的丙烯菊酯(a)和胺菊酯(b)與ssDNA作用紫外光譜

Fig.2 Absorption spectra of DNA (10 μg#61655;mL-1) in the presence of different amounts of (a) allethrin (from 1 to 6: 0， 2.5， 5， 10， 20， 30 μg#61655;mL-1)， and (b) tetramethrin (from 1 to 5: 0， 2.5， 5， 10， 15 μg#61655;mL-1)

DNA分子中平行堆積的堿基、帶負(fù)電荷的磷酸骨架和兩條核苷酸鏈螺旋形成的大溝、小溝構(gòu)成了小分子與DNA相互結(jié)合的位點。DNA與小分子的作用方式有共價結(jié)合和非共價結(jié)合等，而大多數(shù)小分子與DNA的相互作用是非共價結(jié)合的，主要有靜電作用、插入作用和溝槽作用[10]。小分子與DNA的相互作用會引起紫外吸收帶的紅移(藍移)現(xiàn)象或增色(減色)效應(yīng)。

由圖2(a)和(b)可見，DNA在258 nm左右有一個特征吸收峰，隨著丙烯菊酯和胺菊酯的加入，特征吸收峰值均減小，發(fā)生減色效應(yīng)，但最大吸收波長未觀察到明顯移動。因此推測，丙烯菊酯和胺菊酯與ssDNA的磷酸骨架之間可能發(fā)生了靜電吸附作用，使DNA空間軸向收縮[11]。

2.1.2鳥嘌呤，鳥嘌呤核苷與丙烯菊酯和胺菊酯作用紫外光譜

(a)

(b)

圖3鳥嘌呤(a)及鳥嘌呤核苷(b)與不同濃度丙烯菊酯作用的紫外光譜

Fig.3 Absorption spectra of guanine (a) and guanosine (b) in the presence of different amounts of allethrin. The concentration of guanine and guanosine used in (a) and (b) were10 μg#61655;mL-1; the concentration of allethrin used in (a) and (b) from 1 to 6 was 0， 2.5， 5， 10， 20， 30 μg#61655;mL-1

堿基是DNA的重要組成部分，而小分子與DNA的作用有很大一部分涉及到堿基，研究單堿基與小分子的相互作用，有利于進一步了解小分子與DNA作用的細(xì)節(jié)。另外，DNA的氧化性損傷一般發(fā)生在嘌呤堿基上，而鳥嘌呤的氧化電位最低因而最容易被氧化。故以下主要探討鳥嘌呤及鳥嘌呤核苷與丙烯菊酯和胺菊酯的相互作用。鳥嘌呤在248 nm和273 nm處有特征吸收(見圖3(a))，隨著丙烯菊酯的加入，可見其特征吸收峰值明顯減小。鳥嘌呤核苷在253 nm處有特征吸收(見圖3(b))，隨著丙烯菊酯的加入，其特征吸收峰值也減小。但鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥作用后吸光度減小的程度要大于鳥嘌呤與農(nóng)藥的作用后吸光度減小的程度。同樣試驗，胺菊酯與鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷作用得到類似結(jié)果(圖略)。以上結(jié)果說明農(nóng)藥與鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷之間發(fā)生了相互作用，我們認(rèn)為這種作用主要是通過鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷上-NH2的H與農(nóng)藥分子上-C=O的O之間形成的分子間氫鍵得到的，由于鳥嘌呤核苷比鳥嘌呤多了一個戊糖，而戊糖上的-OH也能與農(nóng)藥之間形成分子間氫鍵，所以鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥作用強度要大。

2.2 熒光光譜

2.2.1 DNA與丙烯菊酯和胺菊酯作用熒光光譜

為了驗證丙烯菊酯和胺菊酯與DNA的作用方式，采用熒光光譜法進行了進一步研究。由圖4(a)和(b)可見，ssDNA對農(nóng)藥小分子的猝滅作用要略大于dsDNA對農(nóng)藥小分子的作用，而ssDNA不存在雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此可以判斷丙烯菊酯和胺菊酯與DNA之間沒有嵌插作用。隨著ssDNA濃度的增加，丙烯菊酯和胺菊酯的熒光強度逐漸減弱，而最大發(fā)射波長不變，如圖4(c)和(d)所示。說明丙烯菊酯和胺菊酯與ssDNA磷酸骨架或堿基作用后，可使這兩種農(nóng)藥的熒光猝滅。

外加分子與熒光分子相互作用常會引起熒光猝滅。由分子碰撞引起的為動態(tài)猝滅，生成不具有熒光的基態(tài)物質(zhì)而導(dǎo)致的猝滅為靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅依賴于擴散，溫度增高會導(dǎo)致擴散加快，猝滅常數(shù)會增大;靜態(tài)猝滅常數(shù)會隨溫度的升高而減小，因為溫度升高將導(dǎo)致配合物的穩(wěn)定性降低，所以可通過考察溫度的影響來區(qū)分這兩種猝滅方式[12]。

對于靜態(tài)猝滅過程，根據(jù)體系熒光強度與猝滅劑的關(guān)系，可以推導(dǎo)出以下公式:

其中K為結(jié)合常數(shù)，F(xiàn)0和F分別為加猝滅劑前后體系的熒光強度，[Q]為猝滅劑的濃度。

(a)

(b)

(c)

(d)

圖4不同濃度ssDNA及dsDNA對丙烯菊酯(a)和胺菊酯(b)的猝滅作用;丙烯菊酯(c)和胺菊酯(d)與不同濃度ssDNA作用熒光光譜

Fig.4 Fluorescence quench curves of 10 μg#61655;mL-1 allethrin (a) and 10 μg#61655;mL-1 tetramethrin (b) in different concentration of ssDNA and dsDNA; fluorescence spectra of 10 μg#61655;mL-1 allethrin (c) and 10 μg#61655;mL-1 tetramethrin (d) in different concentration of ssDNA (CssDNA(1-6)=0， 4， 8， 12， 16， 20 μg#61655;mL-1).

表1說明，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)減小，這表明是靜態(tài)猝滅。對實驗數(shù)據(jù)利用動態(tài)猝滅方程 ， 即Stern-Volmer方程進行處理，則雙分子猝滅過程速率常數(shù) ( 為猝滅劑不存在時熒光體分子的平均壽命， 為l0-8s)。丙烯菊酯與ss-DNA之間的 9.77×1011 L#61655;mol-1#61655;s-1，胺菊酯與ss-DNA之間的 1.06×1012 L#61655;mol-1#61655;s-1，而 Kq 的最大理論值約為2.0×1010 L#61655;mol-1#61655;s-1[13]，實驗值遠(yuǎn)大于理論值，進一步說明是靜態(tài)猝滅。

在室溫25℃下，丙烯菊酯中加入ssDNA后體系的熒光強度與DNA濃度之間的線性關(guān)系為: (r=0.9971)，由此可得丙烯菊酯與ssDNA之間的結(jié)合常數(shù)K = 0.0290 mL#61655;μg-1 = 9.06×103 L#61655;mol-1，平均結(jié)合位點數(shù)n=1.02。

同理在室溫25℃下，胺菊酯中加入ssDNA后體系的熒光強度與DNA濃度之間的線性關(guān)系為: (r=0.9967)，由此可得胺菊酯與ssDNA之間的結(jié)合常數(shù)K = 0.0487 mL#61655;μg-1 = 1.52×104 L#61655;mol-1，平均結(jié)合位點數(shù)n=0.85。

2.2.2 離子強度對DNA與擬除蟲菊酯農(nóng)藥作用的影響

當(dāng)農(nóng)藥與DNA是靜電作用時，改變離子強度，由于Na+等陽離子可以中和DNA磷酸骨架上的負(fù)電荷，與農(nóng)藥分子發(fā)生競爭，從而減弱熒光猝滅程度[14]。體系中加入NaCl，考察NaCl的濃度對體系熒光猝滅的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著離子強度的增加，ssDNA與丙烯菊酯和ssDNA與胺菊酯體系的熒光猝滅程度均減小，由此可以進一步推斷，ssDNA與丙烯菊酯和胺菊酯之間均存在著靜電作用。

2.2.3 陰離子猝滅劑對DNA與擬除蟲菊酯農(nóng)藥相互作用的影響

KI是典型的陰離子猝滅劑。通過考察其對小分子的熒光猝滅作用可以判斷小分子與DNA的作用方式。當(dāng)溶液中加入KI時，如果是靜電作用，農(nóng)藥分子沿著DNA的外壁與DNA發(fā)生作用，此時農(nóng)藥小分子仍完全暴露于溶液中， KI對其猝滅效應(yīng)應(yīng)等同于對未加DNA時小分子的猝滅效應(yīng);如果是溝槽作用，KI對其猝滅效應(yīng)應(yīng)大于對未加DNA時小分子的猝滅效應(yīng)[15]。

由圖5可以看出，KI對丙烯菊酯-ssDNA體系的熒光猝滅能力要略大于KI對丙烯菊酯的猝滅，雖然ssDNA的大小溝槽已被破壞，但ssDNA是以線團狀存在于溶液中，在線團的表面形成了可以與小分子發(fā)生氫鍵作用的許多凹點， 所以該實驗表明，丙烯菊酯和ssDNA之間還有溝槽作用存在。同理，由實驗可得KI對胺菊酯-ssDNA體系的熒光猝滅能力等于KI對胺菊酯的猝滅(圖略)，這說明胺菊酯與ssDNA之間只有靜電作用。

圖5KI對丙烯菊酯及丙烯菊酯-ssDNA體系的熒光猝滅作用Fig. 5 Effect of KI on the fluorescence intensity of allethrin in different concentration of ssDNA. 1: Callethrin=15 μg#61655;mL-1， 2: Callethrin=15 μg#61655;mL-1， CssDNA= 10 μg#61655;mL-1

2.2.4鳥嘌呤，鳥嘌呤核苷與丙烯菊酯和胺菊酯作用熒光光譜

(a)

(b)

圖6 鳥嘌呤(a)及鳥嘌呤核苷(b)與不同濃度丙烯菊酯作用熒光光譜

Fig.6 Fluoresence spectra of Guanine(a) and guanosine(b) in the presence of different amounts of allethrin. The concentration of guanine and guanosine used in (a) and (b) were10 μg#61655;mL-1; the concentration of allethrin used in (a) and (b) from 1 to 6 was 0， 4， 8， 12， 16， 20 μg#61655;mL-1

鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷是具有共軛結(jié)構(gòu)的平面分子，在Tris-HCl緩沖液中，它們的熒光較強。從圖6(a)，(b)中可以看出，隨著丙烯菊酯的增加，鳥嘌呤及鳥嘌呤核苷的熒光強度都逐漸減弱。胺菊酯與鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷相互作用的結(jié)果與上述結(jié)果類似(圖略)。而且鳥嘌呤核苷與丙烯菊酯、胺菊酯作用的強度對應(yīng)大于鳥嘌呤與丙烯菊酯、胺菊酯作用的強度，這與紫外的結(jié)果一致。以上結(jié)果進一步說明了鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥產(chǎn)生了分子間氫鍵的作用。

2.3 丙烯菊酯和胺菊酯對NR-DNA體系吸收光譜和熒光光譜的影響

中性紅能夠與DNA發(fā)生嵌插作用[16]。通過實驗可知隨著DNA的加入，中性紅在520 nm的吸收峰增強，在466 nm的吸收峰減弱并伴有紅移。這說明NR與DNA之間存在強的嵌插作用。向NR-DNA體系中加入不同濃度的丙烯菊酯和胺菊酯后，NR-DNA體系的吸收光譜基本不變，這說明農(nóng)藥與NR之間不存在競爭作用，所以農(nóng)藥與DNA之間不是嵌插作用。熒光光譜實驗顯示，加入丙烯菊酯和胺菊酯后對NR-DNA體系的熒光光譜基本沒有影響。這進一步證明農(nóng)藥與DNA之間不存在嵌插作用。

3 結(jié)論

運用紫外光譜，熒光光譜法和NR光譜探針對丙烯菊酯和胺菊酯與DNA(或單堿基)的相互作用模式進行了初步的探討。離子強度，陰離子猝滅劑KI等對農(nóng)藥分子與DNA之間的相互作用都有一定的影響。實驗結(jié)果表明，丙烯菊酯與ssDNA之間存在靜電和溝槽兩種作用方式，而胺菊酯與ssDNA之間主要是靜電作用。鳥嘌呤和鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥之間主要以氫鍵作用結(jié)合，且鳥嘌呤核苷與農(nóng)藥的作用要強于鳥嘌呤與農(nóng)藥的作用。

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