融合標簽技術及其應用

王婭寧　李淑娟

摘要：融合標簽技術是一種基于報告基因的重組DNA技術，融合標簽技術的發展使重組蛋白質的純化、固定及檢測更加快速、簡便，并很快得到了應用。

關鍵詞：融合標簽技術；重組蛋白；應用

融合標簽技術是20世紀末興起的一種基因重組技術，其主要過程是利用重組DNA技術在靶蛋白編碼基因的3'端或5'端融合某種標簽的編碼基因，通過適宜的宿主來表達重組蛋白質[1]，表達的重組蛋白質可以通過融合的標簽與包被在固相基質上的特異配基結合而進行純化。融合標簽技術的發展使重組蛋白質的純化更加快速、簡便。近幾年，隨著新的融合標簽系統的開發，其功能逐漸多樣化，除用于蛋白質純化外，還用于蛋白質定位和檢測等。

1 融合標簽的種類

融合標簽根據其分子量大小可分為兩大類：大的蛋白質分子（或蛋白質結構域及其衍生物）和小的多肽片段。大的蛋白質標簽有GST（谷胱甘肽巰基轉移酶）、SPA（葡萄球菌蛋白A）和GFP（綠色熒光蛋白）等，它的使用會增加目標蛋白的溶解性，但在蛋白結晶和抗體產生等過程中，標簽必須去除。小的多肽標簽有6×His（六聚組氨酸）、HA（流感病毒血凝素表位）、c-myc（人c-myc蛋白表位）、FLAG（專為蛋白純化和檢測設計的八肽）等，多數情況下，由于多肽標簽相對較小，對融合蛋白質結構影響小，不需要從融合蛋白質中切除，因而多肽標簽較蛋白質標簽更為常用。迄今為止，已有文獻較為詳盡地報道了各種融合標簽[2]，其大小從幾個氨基酸到蛋白質不等，相互作用類型包括酶與底物，細菌受體與血清蛋白，六聚組氨酸與金屬離子，抗原與抗體等[3]，表1-1列出了目前報道較多的標簽融合系統。

2融合標簽技術的應用

2.1用于蛋白的純化。

融合標簽技術用于重組蛋白質純化已為大量實驗所證實[4]。理論上，根據親和純化原理可定向設計使目標蛋白質與純化基質之間不發生任何直接相互作用的融合標簽，以避免由于這種直接相互作用造成蛋白質變性。目前已有許多不同的標簽可供利用。它們利用了標簽與固相配體間的相互作用，從而可從復雜的提取物中對標簽融合蛋白進行選擇性的結合和洗脫。目前常用的蛋白純化標簽是GST，His和表位標簽。

最常用的標簽是多聚組氨酸，即His標簽。該標簽由6-10個連續組氨酸組成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His標簽與其它標簽相比有很多明顯優勢：①對金屬離子如鎳、鈷有高度的選擇性和親和力；②與金屬離子的結合不受變性劑（尿素、胍）的影響；③溫和多樣的洗脫條件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各種商品化介質(Ni-NTA-Agarose, Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His標簽的單抗或多抗也被應用于His融合蛋白的純化。

GST標簽是用來從細菌表達系統中純化蛋白較為成功的標簽之一。在該系統中，GST與被標記的蛋白進行融合，融合后的蛋白可在許多表達系統中表達。GST和谷胱甘肽緊密結合，融合蛋白可通過谷胱甘肽固相柱純化，洗脫未結合的蛋白后，結合蛋白可用含游離的谷胱甘肽緩沖液進行洗脫。該系統中被融合的目標蛋白常可正確的折疊成為有功能的區域，故十分有用。該系統的另一個優勢是可快速、溫和地純化，配體谷胱甘肽的成本較低。

表位標簽（HA、c-myc和FLAG等）也已廣泛用于融合蛋白的純化研究。目前已有商品化針對表位標簽的單克隆抗體。為使標簽在純化中發揮良好的作用，在純化過程中應盡量避免使用劇烈的條件使抗體和標簽之間解離，劇烈的條件可使抗原發生不可逆變性，目標蛋白的回收率低。用游離多肽競爭洗脫法洗脫結合在固相抗體上的標簽融合蛋白，是優選的方法。目前，HA，微管蛋白標簽[5]、KT3標簽（SV40大T抗原的羧基末端）[6]和FLAG等已成功的用多肽洗脫方法進行了蛋白純化。

2.2用于蛋白質固定和檢測。

闡明蛋白質之間的相互作用，描繪出蛋白質相互作用的網絡圖譜是蛋白質組學研究的重要內容。用于研究蛋白質之間相互作用已有很多成熟的技術平臺，如生物芯片以及基于表面等離子體共振原理的BIAcore系統。這些技術的關鍵步驟是將某種生物分子（蛋白質、核酸等）固定在固相基質上。利用融合標簽與其配基之間的相互作用可較好地將蛋白固定在固相載體表面。融合標簽通常是一些小的短肽分子或蛋白質，這些標簽在目標蛋白質與固相基質之間起到了一種間隔臂(spacer arm)的作用，極大程度地減少了目標蛋白質與固相基質直接接觸的機會，同時由于融合標簽通常位于融合蛋白質的N端或C端，從而可使其活性中心充分展露，形成一種均質配基表面，而這種均質表面的形成對于生物芯片以及基于BIAcore系統的實驗成功非常關鍵。不同融合標簽系統的使用將為蛋白質的定向固定提供多種多樣的選擇。

用于蛋白檢測的標簽種類較多，其中熒光標簽和表位標簽最為常用，前者可在活細胞中進行檢測，后者可用于細胞染色、免疫沉淀以及免疫印記中蛋白檢測。熒光蛋白標簽可對融合蛋白在活細胞中適時檢測，在研究蛋白定位及其動態變化時具有特別重要的意義。最近開發出更多活性較強的標簽以及發出不同顏色的各種熒光標簽，極大地擴大了熒光蛋白標簽的使用范圍[7]。采用抗GFP抗體可將該標簽用于細胞染色、免疫沉淀以及免疫印記技術中，但是，與分子質量較小的表位標簽相比，分子質量較大的標簽，可能更容易對目標蛋白的調節和功能產生影響。

2.3融合標簽技術在其他領域的應用。

融合標簽可提高重組蛋白的產量，由于外源蛋白質對于宿主菌的異質性，當外源蛋白質在宿主菌內表達時，宿主菌會調動各種機制來阻止外源蛋白質過量表達，導致的直接后果就是我們所需要的目標蛋白質表達量降低。近幾年的研究發現，當外源蛋白質融合某些特定的標簽后，能夠有效增加重組蛋白質的產量[8]。

融合標簽還可增強重組蛋白質的可溶性，外源蛋白質在宿主菌內表達時大多以包涵體形式存在[9]，致使很難獲得大量有活性的天然蛋白質。為了防止包涵體形成，一般可以采用低溫誘導表達蛋白質，但這種方法并非對所有蛋白質都有效。研究發現，一些高度可溶的蛋白質在與其它蛋白質融合后會促進融合蛋白質以可溶形式表達，如MBP等[10]。Invitrogen公司在2004年開發了一種新型的增強可溶性表達的多肽標簽(SET-tag)，該標簽是通過靜電排斥來防止新生多肽相互聚集[11]。

3 展望

親和標簽在蛋白質純化過程中有重要作用，可以幫助穩定蛋白質和提高蛋白溶解性。親和層析得到蛋白質純度可達90-99%。純化系統的選擇取決于蛋白質性質及下游應用。隨著相關技術的發展，越來越多的融合標簽系統不斷被發現，極大地豐富了融合標簽的功能。不同融合標簽系統有其共性，同時也有各自的優勢和缺點。融合標簽系統的選擇受到很多因素制約，如融合標簽系統的純化條件、融合蛋白質自身的性質（pI、細胞定位等）、純化基質及緩沖液成本、融合標簽的可去除性等。綜合考慮融合標簽的各種制約因素，尚沒有一種標簽可以滿足所有應用的需要。因而，兩種甚至多種不同融合標簽的組合使用將成為未來融合標簽技術的發展趨勢。

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