實時定量PCR檢測擬南芥和鹽芥谷胱甘肽過氧化物酶表達水平

趙寶添 孫娜娜 馬志媛 譚偉杰

谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是1957年由MillsRandle在牛紅細胞中發現的。與動物相比,植物中GPX研究起步較晚,1985年Drotar等報道在組織培養的菠菜、玉米、美國梧桐及水生藻類中檢測到該酶活性[1]。植物體中谷胱甘肽過氧化物酶的結構和功能:植物GPX為非組成型表達,但可受脅迫誘導。研究表明,表達GPXmRNA穩態水平在不同環境脅迫下會有所上升,如病原體、高濃度的鹽、重金屬機械刺激或鉛毒等[2]。因此,GPX在植物氧化信號轉導過程中可能起重要作用。有報道指出,模式植物擬南芥GPX可能是潛在的解毒劑,可直接利用GSH為還原劑[3]。擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶家族有7個成員,分別專一定位于胞液、線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和質外體等亞細胞器中(Milla,2002)。這些酶普遍存在且在非生物脅迫下受各種信號通路調節,但目前這些酶在植物體中的功能并不完全清楚。利用模式植物擬南芥的多種突變體來研究GPX的功能,表明ATGPX具有雙重功能:首先可控制H2O2的穩態[4];其次,轉導保衛細胞中H2O2信號,介導細胞應答脫落酸和干旱脅迫的氣孔調節[5]。

1材料與方法

1.1試驗材料

小鹽芥、擬南芥。

1.2試驗方法

提取鹽芥、擬南芥總RNA,RT-PCR為CDNA。實時定量PCR檢測。

鹽芥GPX:5′引物TCGTCCTCTTCCTTTATCGACA ACG;3′引物CGCATCCTTCACGGTGAAATCATAG。

擬南芥GPX:5′引物TCTCTTCCAATTTCTACAACG GGA GC;3′引物CTTAGCATCCTTGACGGTGAAATCG。

反應條件:94℃ 3min(94℃ 40sec;56℃ 30sec;72℃ 1min)30個循環,72℃ 7min。

2結果與分析

由表1可知,擬南芥鹽激處理及對照:以肌動蛋白為內參,2-△△CT值為2.776 626 901>1,表明擬南芥鹽激處理后,谷胱甘肽過氧化物酶表達有所上調且上調較多;鹽芥鹽激處理及對照:以肌動蛋白為內參,2-△△CT值為0.915 945 29<1,表明鹽芥鹽激處理后谷胱甘肽過氧化物酶表達有所下調。

3討論

本試驗把未經鹽激處理的樣品作為參照因子,經內標基因均一化處理后,通過2-ΔΔCT方法計算。根據定義,對于未經處理的參照樣,△△CT=0,而20=1,即未經處理樣本的倍數變化為1,而對于那些經過處理的樣本,相對于參照因子基因表達的倍數為2-△△CT。出現這種結果有幾種可能:一是鹽處理的濃度過高,植物體內產生的活性氧超出了抗氧化系統的清除能力,對植物造成傷害,從而使植物的基因組轉錄受到影響;二是植物為了防御鹽脅迫,適應性地降低了植物基因組的轉錄,從而更有效地利用體內資源;三是在鹽脅迫下谷胱甘肽過氧化物酶通過活性的升高對清除活性氧起到積極作用,通過表達谷胱甘肽過氧化物酶的方式提高耐鹽性;四是此次試驗僅僅檢測了谷胱甘肽過氧化物酶同工酶中的1種,并不能代表全部的谷胱甘肽過氧化物酶情況,植物對鹽脅迫的耐受機制可能很復雜,還需要進一步試驗。

4參考文獻

[1] 沈成國.植物衰老生理與分子生物學[M].北京:中國農業出版社,2001:57-58.

[2] 李曉燕,宋占午,董志賢.植物鹽迫生理[J].西北師范大學學報,2004(3):106.

[3] 徐文東,楊強,徐志偉.谷胱甘肽及其相關酶在生物體內的作用[J].福建熱作科技,1999(24):42.

[4] YUCHEN MIAO,DONG L V,PENGCHENG WANG.An Arabidopsis Glutathione Peroxidase Functions as Both a Redox Transducer and a Scavenger in Abscisic Acid and Drought Stress Responses[J].The Plant Cell,2006(18):2749-2766.

[5] 戚元成,張世敏,王麗萍,等.谷胱甘肽轉移酶基因過量表達能加速鹽脅迫下轉基因擬南芥的生長[J].植物生理與分子生物學學報,2004(30):517-522.