枯草芽孢桿菌抑菌作用的實驗研究

【摘要】 枯草芽孢桿菌抗均蛋白對很多病菌都有抑制或殺滅作用，實驗中對大腸桿菌的拮抗作用進行了研究。結果表明，枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯。

【關鍵詞】 枯草芽孢桿菌；大腸桿菌；紫外線誘變

芽孢桿菌在自然界分布非常廣泛，多數芽孢桿菌的抗菌物質具有抗菌譜廣，對酸堿度要求不高，熱穩定性好，易于進行分子加工等特點，這些都為開發新型天然防腐劑以及生物防治劑提供了很好的條件。枯草芽孢桿菌可由稻草中分離得到，對許多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物。研究枯草芽孢桿菌對大腸桿菌的拮抗作用，并通過紫外誘變手段篩選出高抗大腸桿菌的菌株。

一、材料與方法

1、供試菌種

實驗菌種 ：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌

2、培養基

液體種子培養基：為牛肉膏蛋白凍培養基（不加瓊脂粉）。

固體種子培養基：在液體種子培養基基礎上加入18g/L的瓊脂粉。

3、枯草芽孢桿菌的制備

取稻草約500g，浸泡在清水中2h，再將其煮沸30min，后37℃下培養。24h后再將其煮沸30min，吸取液體1ml于9ml無菌水中，搖勻制成菌懸液，將菌懸液滴兩滴在固體種子培養基上，涂布均勻，37℃下培養48h。最后挑單菌落于液體種子培養基中，37℃下培養48h。

4、枯草芽孢桿菌的紫外誘變

取培養至對數生長期的枯草芽孢桿菌菌液離心（10000r/min，20min），取沉淀收集細胞，用無菌生理鹽水洗滌2次。玻璃珠振蕩15min。分別取10ml菌懸液于5個直徑9cm的無菌培養皿中，搖勻。無菌條件下在30W，60CM的紫外燈下打開培養皿蓋分別照射60s，90s，120s，150s，180s。不同誘變時間處理的菌懸液各取1ml加入液體種子培養基中37℃黑暗下培養24h。同時取1ml未誘變的菌懸液培養作為對照。致死率=（對照組菌數-此誘變時間下菌數）÷對照組菌數×100%

5、誘變菌株的篩選

培養24h的枯草芽孢桿菌吸取1ml于裝有9ml無菌水的試管中，搖勻；再從中吸取1ml菌懸液，重復上個步驟，直至稀釋到10-4。用異步培養法挑選高產單菌落。即將稀釋到10-5的菌懸液涂布平板，然后將其倒扣于裝有一薄層氯仿的培養皿蓋熏蒸50min，讓菌落固定在固體種子培養基表面。移去培養皿蓋，讓平板中的氯仿揮發40min。再取0.5ml 107-108cfu/ml的大腸桿菌菌懸液涂布在此平板上。待平板晾干后37℃培養72h。取所有平板中抑菌圈最大的單菌落擴大培養。

二、結果與分析

1、不同培養時間對抑菌效果的影響

圖1 抑菌圈隨培養時間的變化

枯草芽孢桿菌隨著培養時間的增加，他的抑菌效果總的來說呈上升趨勢，但其中有抑菌圈變小的過程，這不是說明抗菌蛋白的效果降低了，而可能是由抗菌蛋白的產生時間于大腸桿菌的擴增時間的差別造成的。抗菌蛋白是要到枯草芽孢桿菌的平穩期時才會產生，在這之前是由于接種液中含有抗菌蛋白，它在抑制大腸桿菌的生長。當它逐漸消耗而枯草芽孢桿菌處于非平穩期，沒有新的抗菌蛋白產生時，大腸桿菌處于快速增殖的過程，大腸桿菌就會逐漸蔓延，掩蓋部分抑菌圈，就表現為抑菌圈的減小。當枯草芽孢桿菌達到平穩期后，抗菌蛋白大量產生，使大腸桿菌死亡，抑菌圈就逐漸擴大。

2、不同接種量芽孢桿菌對大腸桿菌的抑制效果

圖2 不同接種量對抑菌效果的影響

經過不同劑量的枯草芽孢桿菌抑制大腸桿菌，經測量發現抑菌圈先隨劑量的增加而增加，200μl的時候達到最大；后就逐漸變小。其原因是劑量越多，它含的枯草芽孢桿菌就越多，產生的抗菌蛋白越多，所以抑菌效果越好；但達到一定數量后，在有限的營養中枯草芽孢桿菌之間會產生競爭關系，反而會抑制菌群的生長，降低了抗菌蛋白的產生量。

3、不同紫外誘變不同時間的結果

在30W，60CM處誘變不同時間，60s時致死率最低，但其正突變率太小。隨時間的增加，致死率越來越大，180s時菌種幾乎全被殺死。90s，120s，150s三個時段的致死率相差不大，而且在可接受范圍內。但150s時其正突變率達到104%，是最高的，所以150s誘變時間比較合適。

四、討論

枯草芽孢桿菌抗均蛋白對很多病菌都有抑制或殺滅作用，實驗中對的拮抗作用進行了研究。結果表明，枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯。在農林和經濟作物的病蟲害防治以及蓄禽、水產養殖中傳染病的防治方面，芽孢桿菌及其抗菌物質展現了良好的應用前景。利用芽孢桿菌尤其是枯草芽孢桿菌進行生物防治或者生產微生物殺菌劑以代替劇毒化學藥品是一種可行的策略。

參考文獻：

[1] 彭益強、呂風萍、賀淹才等，激光誘變篩選高產植酸酶黑曲霉菌株的研究[J]，激光生物學報，2002

[2] 石春芝、陶天中、岳瑩玉，神農架自然保護區大九湖芽孢桿菌資源調查[J]，氨基酸和生物科學，2003

[3] 南慶賢、戴瑞彤，中國肉制品微生物安全問題[J]，肉類研究，2004

[4] 韓建榮、董仙芳， 激光誘變青霉 PT95原生質體選育類胡蘿卜素高產菌株[J]，微生物學通報，2002

[5] 陳天游、董思國、田萬紅、袁佩娜、曾明，枯草芽孢桿菌活菌體外拮抗6種腸道致病菌的研究[J]，微生物學雜志，2004

[6] 鐘青萍，納豆菌及其抗菌蛋白的研究，博士論文：南昌大學博士論文，2001