卡托普利對糖尿病大鼠腎臟醛糖還原酶基因表達的影響及其意義

[摘要] 目的 探討卡托普利對糖尿病大鼠腎臟醛糖還原酶基因表達的影響及其意義。方法 建立糖尿病大鼠模型，分為卡托普利干預組和對照組，15周后處死大鼠，從腎臟皮質抽提mRNA，逆轉錄分別用Cy5和Cy3標記，成為兩組cDNA探針。cDNA探針與基因芯片雜交，掃描儀掃描，用軟件進行分析。結果 與對照組相比，干預組醛糖還原酶基因表達下調。結論 卡托普利可能通過下調醛糖還原酶的表達產生腎臟保護作用。

[關鍵詞] 基因芯片;卡托普利;糖尿病;大鼠;Sprague Dawley;基因表達;醛糖還原酶

[中圖分類號] R966;R587 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)36-18-02

Effect of Captopril on Kidney Aldose Reductase Gene Expression in Diabetic Rats

HUANG HuibinHOU JianmingCHEN GangWEN JunpingLIANG JixingLI Liantao

Department of Endocrinology，Fujian Provincial Hospital·Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China

[Abstract] Objective To study the effect of captopril on the expression of aldose reductase gene in renal tissue from diabetic rats. Methods Diabetic rats were divided into captopril intervention group and control group. All diabetic rats were killed 15 weeks after intervention，and cDNA probes were prepared by labeling the captopril intervened tissue mRNA and the controled tissue mRNA with fluorescent Cy5 and Cy3 respectively through reverse transcription. The cDNA probes were hybridized against the gene chip and then the fluorescent signals were scanned. Results compared with the control group，the aldose reductase gene was down-regulated in the captopril intervention group. Conclusion Captopril may provide renal protection by down-regulating the expression of aldose reductase.

[Key words] DNA microarray;Captopril;Diabetes mellitus;Rats;Sprague Dawle;Gene expression;Aldose reductase

研究表明，醛糖還原酶(aldose reductase，AR)與糖尿病腎病(DN)的發生發展密切相關。血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)對糖尿病具有腎臟保護作用，但與AR之間的關系還不清楚。本課題用卡托普利對糖尿病大鼠進行干預，用基因芯片技術比較干預組與對照組間腎皮質AR基因表達的差異，探討卡托普利是否可以通過改變AR的表達對糖尿病患者起腎臟保護作用。

1材料與方法

1.1糖尿病動物模型制作

雄性SD大鼠16只，體重(248±14.7)g，空腹12h后按60mg/kg體重腹腔注入鏈脲佐菌素STZ，日1次。注射48h后檢測血糖濃度，5周后血糖濃度持續大于16.6mmol/L，表明糖尿病成模。16只大鼠隨機分成干預組和對照組各8只，干預組按每天1.5mg/kg給予卡托普利口服，15周后將大鼠處死，取腎臟皮質凍存備用。

1.2探針制備

用Trizol(Invitrogen公司)抽提腎臟皮質總RNA，用mRNA藥盒(Quagen 公司)純化mRNA。參照Schena等[1]的方法反轉錄并標記cDNA探針。用Cy5-dUTP標記干預組，用Cy3-dUTP標記對照組。將兩組cDNA探針混合，乙醇沉淀后溶解在20μL5×SSC+0.2%SDS雜交液中。

1.3雜交及洗滌

將基因芯片(上海博星基因芯片有限公司)和兩組混合的雜交探針分別在95℃水浴中變性5min，將探針加在基因芯片上，用蓋玻片封片，置于42℃雜交15～17h，然后揭開蓋玻片，分別用2×SSC+0.2%SDS，0.1%SSC+0.2%SDS，0.1%SSC洗滌10min，室溫晾干后掃描。

1.4檢測

用ScanArray5000掃描芯片，用ImaGene3.0軟件分析掃描結果中Cy5和Cy3兩種熒光信號的強度和比值。用管家基因對信號進行均衡和修正[2]。

1.5判定標準

基因差異表達的判定標準:(1)Cy5和Cy3信號比值的自然對數的絕對值>0.69(即Cy5/Cy3 >2.0或<0.5);(2)Cy5和Cy3信號值兩者皆大于200或其中之一大于800。Cy5/Cy3>2.0或<0.5分別表示干預組與對照組相比基因表達上調或是下調。

2結果

基因芯片結果顯示整張芯片雜質或背景干擾均勻，管家基因均被檢測到，提示mRNA質量良好，因此基因芯片表達結果可靠。在差異表達并且有功能的基因中，AR在對照組的信號值Cy3為3494.2，在干預組的信號值Cy5為803，

Cy5/Cy3=0.230，提示干預組與對照組相比，AR表達下調。

3討論

AR屬于還原型輔酶Ⅱ依賴性醛-酮還原酶族，廣泛分布于神經、心臟、腎小球、視網膜、晶體和血管壁等非胰島素依賴性組織[3]。

已有大量研究表明，多元醇通路的激活與DN密切相關。AR是多元醇通路的限速酶。當血糖濃度維持在正常生理水平時，它對葡萄糖的親和力較低，此時葡萄糖很少轉化為山梨醇。在高血糖狀況下，磷酸己糖激酶被飽和，這時AR被激活，促使體內的葡萄糖轉化為山梨醇。然而山梨醇脫氫酶的活力并未相應地成比例增加，造成山梨醇的堆積。由于山梨醇不易透過細胞膜，細胞內滲透壓升高，細胞腫脹，細胞外液的肌醇進入受限，細胞內肌醇下降，影響磷酸化過程，Na/K-ATP酶活性降低，細胞功能障礙。

新近的研究表明，多元醇激活還參與了蛋白非酶糖基化[4]、氧化應激[5]、蛋白激酶C[6]激活等與DN有關的生化、病理生理過程，可能是DN發生發展的始動因素。因此，AR的表達下調可以抑制多元醇通路的激活，延緩DN的發生發展。

AR被認為是DN發生發展的因素之一，ACEI對DN的保護作用已被大量的循證醫學所證實，但到目前為止ACEI與AR之間的關系很少報道。Cotter[7]等報道lisinopril(一種ACEI制劑)與AR抑制劑合用對改善糖尿病大鼠坐骨神經血流和傳導速度有協同作用，但并未發現lisinopril改變AR抑制劑對多元醇通路的影響。

本研究通過基因芯片技術發現卡托普利可以使糖尿病大鼠AR表達下調，其意義在于:(1)預示ACEI的作用可能與AR存在關聯，AR可能是ACEI的作用靶點;(2)DN之前應用ACEI可能可以通過下調AR的表達延緩DN的發生。

[參考文獻]

[1] Schena M，Shalon D，Heller R，et al. Parallel human genome analysis:microarray-based expression monitoring of 1000 genes[J]. Pnas，1996， 93(20):10614-10619.

[2] Schena M， Shalon D， Dais RW， et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J]. Science，1995，270(20):467-470.

[3] 朱禧星. 現代糖尿病學[M]. 上海:復旦大學出版社，2001:300.

[4] Tsukushi S，Katsuzaki T，Aoyama L，et al. Increased erythrocyte 3-DG and AGEs in diabetic hemodialysis patients:role of the polyol pathway[J]. Kidney Int，1999，55(5):1970-1976.

[5] Bravi MC，Pietrangeli P，Laurenti O，et al. Polyol pathway activation and glutathione redox status in non-insulin-dependent diabetic patients[J]. Metabolism，1997，46(10):1194-1198.

[6] Ishii H，Tada H，Isogai S. An aldose reductase inhibitor prevents glucose-induced increase in transforming growth factor-βand protein kinase activity in cultured human mesangial cells[J]. Diabetologia，1998，41(3):362-367.

[7] Cotter MA， Mirrlees DJ， Cameron NE. Neurovascular interactions between aldose reductase and angiotensin-converting enzyme inhibition in diabetic rats[J]. Eur J Pharm，2001，417(3):223-230.

(收稿日期:2009-09-09)