甜瓜同源四倍體的創制及其初步定性研究

賈媛媛　張永兵　刁衛平　陳勁楓

摘要：通過未成熟胚子葉的組織培養創造體細胞無性系變異，誘導出了齊甜1號的同源四倍體甜瓜，激素質量濃度以BA3.0mg/L為佳，加倍率為14.3％。對再生的同源四倍體及二倍體甜瓜植株進行了莖、葉、花、果實、種子的形態觀察，及各項形態指標和主要品質指標的測定。結果表明：除果形指數變小外，四倍體植株的莖、葉、花、果實、種子各項形態指標的值均顯著大于二倍體。同時，四倍體甜瓜維生素C、可溶性糖含量也顯著高于二倍體。

關鍵詞：甜瓜；未成熟胚子葉；同源四倍體；形態；品質

同源多倍體是遺傳和育種研究的重要材料。多倍體的“巨型性”及次生代謝產物增加和抗逆性增強的特性可被用來改善植物農藝性狀、增加產量、改善品質。多倍體育種可創造新的種質資源，擴大種質資源的利用范圍，通過多倍體誘變、遠緣雜交等使野生種與栽培種的優良性狀相結合，產生并固定雜種優勢。

在植物多倍體誘導中，利用組織培養過程中的無性系體細胞變異出現自然加倍獲得四倍體再生植株具有成功率高、可一定程度避免嵌合體的產生及條件易調控等優點。本文通過未成熟子葉培養過程篩選鑒定同源四倍體甜瓜，建立同源四倍體誘導體系，并且對獲得的同源四倍體甜瓜進行了形態觀察和品質測定，為甜瓜多倍體育種實踐打下了一定的基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為早皇后、9904、4810、黃金瓜、齊甜1號、新青玉，其中早皇后是地方常規品種，4810為多抗源復合雜交后的低代自交系，其余4個為雜交F，代品種。試驗于2006年在南京農業大學進行。

1.2方法

1.2.1未成熟子葉培養從田間摘取發育18～23d的未成熟果實，經流水沖洗果面后在超凈工作臺上用75％的酒精進行表面消毒。然后剖開果實，取出尚未發育成熟的種子。去掉種皮并切取近胚軸端子葉中部組織作為外植體，接種在誘導無性系變異培養基上。誘導培養基共4種，分別為：MS+BA 1.0mg/L；MS+BA 2.0 mg/L；MS+BA 3.0 mg/L；MS+BA 4.0mg/L。每個處理接種約20個外植體，置于弱散射光條件下誘導培養。培養至葉面或葉緣產生芽叢后，將芽叢及時切下，轉移到生長培養基(MS+BA 0.2 mg/ L)上，以促進芽伸長。

除特別說明外，所有培養基均為固體培養基，附加3％蔗糖，0.8％瓊脂，pH值5.8左右。培養條件：溫度(25±2)℃，每日光照16 h，光照度2 000 lx左右。

1.2.2倍性鑒定將馴化后的植株移栽于南京農業大學蔬菜試驗基地。植株長出2-3片真葉后，取長0.5～1.0 cm的細嫩卷須，參照陳勁楓等的方法進行有絲分裂染色體制片，以確定植株染色體數目，統計處理芽數、愈傷組織數、出芽數、變異芽數和加倍芽數，計算出愈率(愈傷組織數/處理芽數)、出芽率(出芽數/處理芽數)、變異率(染色體數目發生變異的株數/處理芽數)和加倍率(加倍株數/處理芽數)。

1.2.3形態性狀觀察甜瓜進入盛花期，測量植株第3、5、7、9節的節間長、莖粗、葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗等形態指標；每株分別取5朵當天開放的雌、雄花，測量花萼長、花辦長和花辦寬。授粉20d后測果實縱徑、果實橫徑、單果質量并計算果形指數(果實縱徑/果實橫徑)。果實成熟期，采摘四倍體再生植株及二倍體植株果實5個，每個單瓜隨機選擇20粒種子進行觀察、測量。

1.2.4維生素C及可溶性糖含量的測定參照李合生的方法，從田間摘取發育正常的甜瓜果實，洗凈、擦干，用不銹鋼刀取果肉2g，磨碎后用比色法測定維生素C含量。同時，采用蒽酮比色法測定葉片可溶性糖含量。均重復3次，數據采用SPSS軟件進行LSD測驗。

2結果與分析

2.1未成熟胚子葉經誘導后組織再生情況

白色的未成熟胚子葉外植體(圖版1 A)接種在誘導培養基上2～5 d后急速膨大變綠(圖版1B)，切口邊緣形成少量愈傷組織，10～15 d后子葉邊緣或表面開始分化出芽叢(圖版1C)或形成愈傷組織塊(圖版1D)。出芽部位多集中在外植體近下胚軸一端切口邊緣與維管束交接處，另一端則較少，30d左右芽長達1～2 cm。將芽叢切下轉移至伸長培養基中培養(圖版1 E)，離體條件下發生變異的小植株已經可以看出其葉片與普通二倍體的不同(圖版1 F)。將所有植株生根后進行馴化。

2.2不同質量濃度的激素對甜瓜未成熟胚子葉再生及加倍的影響

試驗共設4個不同BA質量濃度誘導甜瓜無性系變異的發生。表1結果顯示，BA較高的培養基出愈率也較高，出芽率則相對較低；相反，BA較低的培養基出愈率較低，出芽率則較高。觀察得到，BA質量濃度較高的培養基相對于較低的培養基，芽叢和愈傷組織塊較為緊實，分化單芽頻率也較低，而低BA質量濃度培養的芽叢和愈傷組織塊則相對疏松，分化單芽頻率也較高，

不同BA質量濃度誘導外植體產生無性系變異，成株訓化后經細胞染色體計數鑒定，獲得了2n=48的四倍體。各處理的誘導結果如表l所示。BA質量濃度不同對四倍體出現頻率有較大影響。表1顯示，齊甜1號以BA 3.0 mg/L最好，加倍率達到14.3％，而4.0 mg/L時加倍率僅為6.9％。

2.3再生四倍體植株形態特征觀察

由表2～4可知，除節間長、葉柄長、萼片長、果形指數、單果質量外，四倍體植株的莖、葉、花、果實、種子的大多數形態指標值顯著大于二倍體，且除雄花、雌花的萼片長外，二者的差異都達到了極顯著水平。四倍體的果形指數為0.78，二倍體為1.68，二者差異極顯著。

根據田間觀察結果可知，由于四倍體植株的莖、葉、花外形上具有明顯的巨大性，生長較為緩慢，葉片肥厚，形狀鈍圓，葉色深綠(圖版2A右)，畸形葉較多，且多發于植株較低或基部節位(圖版2 B、C、D)，再生的四倍體植株莖節變得短粗，分枝力較之二倍體植株差，開花期，花器官變大，花辦顏色變深(圖版3)，花辦肥厚，雌蕊和子房增大，且大多數雌花著生于主蔓莖節基部，而二倍體植株的雌花則多著生在延伸出的側蔓上：果形指數極顯著低于二倍體，果實較為短粗(圖版4A)；種子增大加厚，呈淡褐色，表面有少許光澤，二倍體種子呈淡黃灰色，表面無光澤(圖版4B)。

2.4四倍體甜瓜的品質變化

表5結果顯示，四倍體的維生素C與可溶性糖含量都極顯著高于二倍體，其中可溶性糖含量超過了二倍體的2倍。這表明。四倍體甜瓜在風味上有所變化，甜度增加：維生素C含量的增加表明營養價值也有所增加。

3討論與結論

植物體細胞無性系變異是指植物細胞經組織培養產生的遺傳變異。體細胞無性系變異是植物組織培養中的普遍現象。難以預料的染色體變異給某些作物的改良帶來了機會，也開辟了一條染色體加倍的新途徑。

在甜瓜子葉組織培養中，子葉不定芽的分化具有明顯的極性現象。這種極性現象主要表現在不定芽的誘導上。靠近胚軸部位的子葉塊不定芽的誘導率高于遠離胚軸端的子葉塊，而且在每個了葉塊中也存在這種極性現象，即子葉塊的切口中，靠近胚軸的切口容易產生不定芽，遠離胚軸的切口則難以形成不定芽。

子葉能否誘導出不定芽有2個關鍵因素：一是子葉苗齡，二是激素質量濃度。有學者認為，采用未成熟甜瓜子葉進行組織培養時有時間上的優勢。馬國斌等叫在用不同日齡的甜瓜子葉塊作為外植體時觀察到叢生芽的誘導率隨著子葉日齡的增長而下降，這種現象被認為是由于此時細胞生理上處于“幼態”，全能性細胞多的緣故。

本試驗對再生的四倍體及二倍體甜瓜植株進行了莖、葉、花、果實、種子的形態觀察，及各項形態指標和主要品質指標的測定。結果表明，除果形指數變小外，四倍體植株莖、葉、花、種子各項形態指標的值均顯著大于二倍體，體現出了基因的劑量效應。因此，在對植株進行鑒定時，可以結合四倍體的形態特征及生長緩慢且分枝力差等特點初步篩選變異株，再進一步采用染色體制片技術確定植株倍性，這樣可大大節約倍性鑒定時間，減少工作量。本研究還發現，四倍體甜瓜的維生素C、可溶性糖含量也顯著高于二倍體，說明二倍體甜瓜經染色體加倍后品質得到了改善，營養價值也有所提高。