42種藥用植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

王學貴 伍智華 沈麗淘 田永清

（1.農藥與化學生物學教育部重點試驗室，華南農業大學，廣州，510642；2.四川農業大學農學院）

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

42種藥用植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

王學貴1，2伍智華2沈麗淘2田永清1

（1.農藥與化學生物學教育部重點試驗室，華南農業大學，廣州，510642；2.四川農業大學農學院）

運用菌絲生長速率抑制法測定了42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病的抑菌活性。試驗結果表明，心籽絞股藍、海南五針松、水馬桑3種植物提取物對番茄灰霉病菌的抑菌作用較好，在5 mg/mL濃度下抑制率分別為83.68%，76.21%，60.88%；并進一步測定心籽絞股藍、海南五針松及水馬桑對番茄灰霉病的毒力，其分別為1.000 mg/mL，3.275 mg/mL及5.050 mg/mL。心籽絞股藍表現出對番茄灰霉病菌有較好的抑制作用，但其抑菌活性成分還需進一步深入研究。

番茄灰霉病 植物甲醇提取物 心籽絞股藍 抑菌活性

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，由于含有豐富的營養成分，在人們日常生活中占有舉足輕重的地位。番茄灰霉病是番茄生產過程中的主要病害之一，常造成果實腐爛，一般減產20%～30%，嚴重的高達50%以上，對番茄生產構成極大威脅[1]。目前，在防治灰霉病上主要選用苯并咪唑類的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類的腐霉利，異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威等藥劑。長期單一的使用該類藥劑使得番茄灰霉病菌對其產生了嚴重的抗藥性，同時加大劑量防治導致農藥殘留的問題越來越嚴重[2～4]。因此，開發高效、低毒、低殘留的“環境和諧農藥”（environment acceptably/friendly pesticides），有效防治番茄灰霉病已經成為當務之急[5]。

植物源農藥由于對人畜安全無毒，對環境安全及對病蟲的殺傷特異性強等[6]，已受到社會的廣泛關注。科學研究工作者對其進行了大量的研究，如我國曾以大蒜素分子結構為模板衍生合成了乙蒜素，成功開發出“抑菌素401”和“抑菌素402”，用來防治甘薯黑斑病、小麥腥黑穗、棉花苗期病害等[7]；黃樂平等[8]通過對新疆幾十種植物抑菌活性的測定，發現了7種植物對黃瓜霜霉病有較好的防效，并進一步對其中的4種植物抑菌活性研究后，復配出抗病增產劑I號、Ⅱ號、Ⅲ號；孟昭禮等[9]經過對銀杏抑菌活性十幾年的潛心研究，現已通過仿生合成開發出“綠帝乳油”，并已經獲得專利。另外，還采用人工模擬技術合成一種農用殺菌劑銀泰。Dev U等[10]研究發現，植物芳香成分中的丁子香酚、甲基丁子香酚、檸檬醛、2-苯乙醇等6種化合物對5種種子病原真菌的菌絲生長有強烈的抑制作用，在植物病害防治和檢疫中具有潛在的應用價值。

因此，對植物進行殺菌活性篩選，尋找具有高效殺菌活性的特有植物，對探索結構新穎的可直接應用于農業病害防治或進行仿生合成尋找先導化合物，具有重要意義。本研究對42種藥用植物甲醇提取物對番茄灰霉病進行了生物測定，為從植物中分離出對番茄灰霉病具有高活性的化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

②供試植物材料 除峨眉菝葜采自峨眉山之外，其余41種植物均采自重慶金佛山國家自然保護區。品種如下：蛇足石杉（Thunb.ex Murray）峨眉菝葜、檫木海南五針松巖木瓜Corner）、珍珠蓮Oliv.）Corner）、南川木菠蘿

③供試溶劑 丙酮（AR級），甲醇（AR級），無菌水。

④供試儀器 DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱，LDZX-50FA立式電熱壓力蒸汽滅菌器，SPX生化型培養箱，FZ-102型粉碎機，EYELA-1000型濃縮儀，DPH-6123型真空干燥箱，CP224S電子分析天平。

1.2 試驗方法

①植物樣品前處理與活性物質的提取a.植物樣品的干燥與粉碎。將采集的各種樣品約500 g自然風干，再利用真空干燥箱干燥，箱內溫度為55℃，壓力為0.05 Pa，直到植物樣品完全干燥為止。用粉碎機進行粉碎，得到60目（孔徑0.246 mm）篩的植物樣品粉末備用。

b.植物甲醇提取物的提取。采用冷浸法進行提取：稱取50 g供試植物干粉裝入大型廣口瓶 （體積1000 mL）中，然后加入500 mL甲醇進行提取，5 d后濾出浸提液，采用旋轉蒸發儀減壓濃縮。采用以上方法再重復提取2次，合并所得的甲醇浸膏，稱重存儲于冰箱中備用[11]。

②植物甲醇提取物的抑菌活性篩選 采用菌絲生長速率抑制法[7]。分別準確稱取每種植物甲醇浸膏0.5 g溶解于2 mL丙酮中，然后加無菌水至10 mL，配成50 mg/mL母液，用20 W紫外燈照射30 min備用。配制母液過程中，如果浸膏溶解性不好，可加入2～3滴吐溫80進行攪拌，同時輔助超聲波處理10 min增加其溶解性，形成均一穩定的藥液備用。

用1 mL的移液管取1 mL母液轉移到培養皿中（Φ=9.0 cm），然后用10 mL移液管移取9 mL熔融培養基（50～60℃）到培養皿，形成5 mg/mL的含毒培養基，對照為0.2 mL丙酮+0.8 mL無菌水+9 mL培養基，每處理重復3次。最后在冷卻培養基表面接種菌餅（Φ=0.5 cm），然后放入28℃恒溫培養箱中培養，72 h后采用“十”字交叉法測定菌落直徑。

③抑菌活性較好的提取物對番茄灰霉病毒力的測定 每個提取物設置5個濃度梯度處理，其余同②。

④數據處理 計算各處理抑制率。將濃度轉化為濃度常用對數，抑制率轉化為幾率值，建立毒力回歸方程（=a+b），求出毒力及95%的置信區間。

抑制率（%）=[（對照菌落擴展直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5×菌餅直徑）]×100%。

2 結果與分析

2.1 42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌的生物活性

試驗結果表明，心籽絞股藍、海南五針松及水馬桑對番茄灰霉病菌表現出較強的抑制活性，其抑制率分別為83.68%，76.21%及60.88%，且與其余處理差異顯著；在試驗中也發現有些植物提取物對菌絲不但沒有抑制作用，反而還具有促進作用，比較顯著的是金線草，其抑制率為-22.55%；其次為冬桃（枝葉），為-14.40%，川牛膝也達到了-11.66%（表1）。

2.2 抑菌活性較好的提取物對番茄灰霉病毒力測定

表1 42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病的抑菌活性

毒力測定結果表明，心籽絞股藍、海南五針松及水馬桑對番茄灰霉病的分別為1.000 mg/mL，3.275 mg/mL和5.050 mg/mL（表2）。

3 結論與討論

3.1 結論

通過測定42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病的生物活性，篩選出心籽絞股藍、海南五針松、水馬桑對番茄灰霉病具有較好的抑制作用，其抑制率均達到60%以上；通過對這3種植物提取物進行毒力測定，其有效中濃度分別為：心籽絞股藍1.000 mg/mL、海南五針松3.275 mg/mL、水馬桑5.050 mg/mL。綜合以上結果表明，心籽絞股藍對番茄灰霉病的抑菌效果最好。

3.2 討論

本試驗中發現某些植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌有促進作用，如在5 mg/mL濃度下，金線草、冬桃（枝葉）及川牛膝的提取物對番茄灰霉病菌的抑制率分別為-22.55%，-14.40%及-11.66%。針對這種情況，其原因可能是在植物中同時存在抑菌、促菌2類活性物質。隨著濃度的降低，其抑菌、促菌活性物質比例不同，導致結果不同[12]。但具體原因目前還未見報道，值得進一步研究。

心籽絞股藍是葫蘆科絞股藍屬多年生攀緣草本植物。有相關研究表明同屬植物絞股藍具一定的廣譜抗菌活性[13]，其主要成分為皂苷、多糖、黃酮類化合物、有機酸和微量元素等多種化學成分[14]。廣泛研究表明，皂苷與黃酮類化合物具有較強的抑菌活性，如空心蓮子草皂苷類物質對細菌和真菌均有一定程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、黑曲霉和根霉有明顯的抑菌作用[15]；水溶性海參皂苷對黃瓜枯草病原菌和葡萄炭疽病菌，以及黑曲霉菌也具有顯著的抑菌活性[16]；節節草地上部含有豐富的黃酮類化合物，其對大腸桿菌和八疊球菌等有明顯的抑制作用[17]；苦參中黃酮類化合物也對細菌和真菌有抑制作用[18]。所以，心籽絞股藍對番茄灰霉菌表現出抑菌效果，可能與該種植物中含有豐富的黃酮和皂苷類次生代謝物質有關，但活性物質的分離和結構的鑒定還需要進一步深入研究。

表2 3種植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌的毒力測定

[1]姜巍，王德爽.番茄灰霉病的綜合防治[J].現代農業，2007（8）：22.

[2]丁中，劉峰，慕立義.不同抗性型灰葡萄孢對不同作用機制殺菌劑的敏感性研究[J].農藥學學報，2001，3（4）：59-63.

[3]徐作珽，李林，于建壘，等.蔬菜灰霉病對腐霉利抗藥性變異及其治理[J].植物保護學報，2001，28（1）：33-38.

[4]楊濤，關天舒.保護地番茄灰霉病菌抗藥性治理策略的理論模型與實踐[J].中國農業科學，2002，35（8）：1030-1032.

[5]操海群，岳永德，花日茂，等.植物源農藥研究進展（綜述）[J].安徽農業大學學報，2000，27（1）：40-44.

[6]周仕濤.我國植物源農藥的研究及前景[J].西南農業學報，2004，17（4）：525-529.

[7]趙善歡.植物化學保護.3版[M].北京：中國農業出版社，2000：301-312.

[8]黃樂平，田黎，師聽.植物性殺菌劑防治溫室黃瓜霜霉病研究[J].新疆農業科學，1997（1）：34-36.

[9]孟昭禮，袁忠林，羅蘭，等.人工模擬農用殺菌劑銀泰對5種植物病害的藥效試驗[J].萊陽農學院學報，2001，18（4）：302-305.

[10]Dev U,Devakumar C,Mohan J,et al.Antifungal Activity of Aroma Chemicals Against Seed-borne Fungi[J].Essent Oil Res，2004(16)：496-499.

[11]黃桂榮，李有志，徐大高，等.9種湘西植物甲醇提取物的抗真菌活性[J].仲愷農業技術學院學報，2005，18（4）：49-52.

[12]韓建華.植物源抑菌活性物質初步研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2002.

[13]曾曉黎.絞股藍的體外抗菌活性試驗[J].中成藥，1999，21（6）：308-310.

[14]劉欣，葉文才，蕭文鸞，等.絞股藍的化學成分研究[J].中國藥科大學學報，2003，34（1）：21-23.

[15]程超，秦恩華，朱玉昌，等.空心蓮子草皂苷類物質功能特性研究[J].食品與發酵工業，2003，33（12）：60-62.

[16]叢日山，袁文鵬，樊廷俊，等.仿刺參水溶性海參皂苷的分離制備及抗真菌活性的研究[J].中國海洋大學學報，2006，36（6）：959-964.

[17]李國慶，艾尼娃爾·艾克木，李佳，等.節節草黃酮類化合物的提取及抑菌活性研究[J].生物技術，2008，18（4）：34，44，54.

[18]鄭津輝，王威，黃輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學學報：理學版，2008，54（6）：439-442.

Preliminary Studies on the Antifungal of 42 Medical Plant Species Methanol Extracts against

The antifungal activities of 42 species medical plant methanol extracts were tested on thePers. with a growth rate method.The results showed that the antifungal activities against thePers.ofCogn.ex Oliv.,Hand.-Mazz.andWall.(5 mg/mL)were better than other treatments,and the inhibition rates were 83.68%,76.21%,60.88%,respectively.Also deeply detected the toxicities of three plants againstPers.and theof them were 1.000 mg/mL,3.275 mg/mL and 5.050 mg/mL.So G. cardiospermum Cogn.ex Oliv.has shown good antifungal activity against thePers.and the active ingredients would be worthy of further study.

Pers.;Plant methanol extracts;Cogn.ex Oliv.;Antifungal activity

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.028

王學貴（1976-），男，博士研究生，講師，主要從事植物源農藥研究。E-mail:wanderwxg@sican.edu.cn

2009-03-10