低強度激光對電刺激引起的Ｃ２Ｃ１２自由基損傷的光生物調節作用

摘要:利用電刺激C2C12作為細胞模型，研究低強度激光對電刺激引起的C2C12線粒體功能自由基損傷的光生物調節作用#65377;以45 V 20 ms 5 Hz電刺激C2C12細胞，采用固定照射時間#65380;不同照射強度的LIL，以熒光探針標記法檢測電刺激及LIL對ROS含量的影響，研究LIL對電刺激后肌管ROS的代謝變化的影響#65377;結果:1)ES 75 min組與對照組比較ROS生成顯著增加(P<0.01)，線粒體功能顯著性下降(P<0.05)，電刺激引起的C1C12線粒體功能自由基損傷的細胞模型建立;2)0.33～8.22 J/cm2激光對正常培養細胞線粒體功能無影響，但可以改善電刺激引起的線粒體功能低下的狀態，此劑量段為PBM的作用劑量范圍;3)0.33～2.646 J/cm2激光可以促進細胞內穩態的康復，其機制主要與通過光化學作用提高機體的抗氧化作用有關#65377;結果說明:適當劑量的低強度激光對骨骼肌細胞有光生物調節作用，是一種無損傷的促進運動性疲勞或自由基損傷康復的新型手段#65377;

關鍵詞:運動醫學;低強度激光;光生物調節作用;電刺激;小鼠骨骼肌肌母細胞

中圖分類號:G804.5;G804.7文獻標識碼:A文章編號:1006-7116(2008)01-0100-05

Effects of photobiological modulation of low intensity laser on the damage of free radicals of C2C12 caused by electrical stimulation

ZHAO Xiu-feng1，2，XU Xiao-yang2，LIU Cheng-yi2，PAN Hong-ying2

(1.Department of Physical Education，Taishan University，Taishan 271021，China;2.School of Physical Education，South China Normal University，Guangzhou 510631，China)

Abstract: By utilizing electrically stimulated C2C12 as the cell model， the authors studied the effects of photobiological modulation (PBM) of low intensity laser (LIL) on the damage of functional free radicals of mitochondria of C2C12 caused by electrical stimulation. The authors applied electrical stimulation with such parameters as 45 V， 20 ms and 5 Hz to stimulate C2C12， tested the effects of electrical stimulation and LIL on the content of reactive oxygen species (ROS) by using fixed radiation time， LIL at different levels of radiation intensity and fluorescent probe marking method， studied the effects of LIL on the metabolic change of ROS of myotubes after electrical stimulation， and revealed the following findings:1) comparing the 75 min electrically stimulated group with the control group， the production of ROS is significantly increased (P<0.01)， wile the functions of mitochondria are significantly weakened (P<0.01)， which indicate that the cell model of the damage of functional free radicals of mitochondria of C2C12 caused by electrical stimulation is established; 2) laser at the energy level of 0.33～8.22 J/cm2 has no effect on the functions of mitochondria of normally cultured cells， but can improved the condition of low performance of mitochondrial functions， this rang of energy level is the functional range of PBM; 3) laser at the energy level of 0.33～8.22 J/cm2 can boost steady recovery within the cells， whose mechanism is chiefly related to enhancing the anti-oxidation function of organisms via photochemical action. The said findings indicate that an appropriate level of low intensity laser has the effects of PBM on skeletal muscular cells， being a new trauma free means that can boost the recovery of kinetic fatigue or free radical damage.

Key words: sports medicine;low intensity laser;effects of photobiological modulation;electrical stimulation;skeletal muscular myotube metrocytes of mice (C2C12)

延遲性肌肉酸痛(DOMS)等運動性肌肉疲勞是競技運動和大眾健身中常見的現象，但還沒有有效的防治辦法^[1]#65377;光生物調節作用(PBM)已獲得了廣泛的應用^[2]#65377;研究表明，PBM可以調節多種組織，產生多種細胞及亞細胞效應，包括對細胞活性降低的康復效應^[3]#65377;PBM對細胞無毒副作用，可能是一種治療運動損傷的綠色手段^[4]，業已發現PBM對強直性肌肉收縮有一定療效^[5]，對DOMS雖然可以緩解疼痛但無助于損傷的恢復^[6-7]#65377;大量的研究表明，電刺激C2C12(小鼠骨骼肌肌母細胞)肌管引起其收縮，所導致的ROS(Reactive oxygen species，活性氧)增加和線粒體功能下降可以模擬運動時由線粒體自由基損傷引起的骨骼肌疲勞^[8]，本文應用這個肌肉疲勞的細胞模型^[9]來研究PBM機理#65377;為了進一步探討相關的機理，本文沿用國際慣例開展細胞模型^[8-9]研究#65377;

鑒于肌肉組織在皮膚組織下面，激光需要有一定的穿透深度#65377;810 nm與其他波長激光相比具有較強的組織穿透深度^[10]，因此有望成為一種重要的在體治療運動性肌肉損傷與消除疲勞的“綠色”療法^[9]#65377;到目前為止還沒有人研究過低強度紅外激光對肌細胞的PBM#65377;為了進一步探討肌細胞的PBM，本文應用810 nm低強度Ga-Al-As半導體激光研究電刺激誘導的肌管線粒體功能退化的PBM，為PBM的臨床應用提供理論依據#65377;

1材料與方法

1.1試劑與儀器

C2C12 細胞由中國醫學科學院基礎醫學研究所提供;活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所;高糖DMEM#65380;胎牛血清#65380;馬血清#65380;胰蛋白酶等為GIBCOBRL產品，MTT為Sigma產品;TY-C型電刺激器購自成都儀器廠，刺激電極及細胞培養皿為本實驗室自行設計制造;960MC 熒光分光光度計購自上海三科儀器有限公司;810 nm SUNDOM-300IB半導體激光器由北京三頓電子技術有限公司生產;TQ8210型功率計為ADVANTEST公司產品#65377;

1.2方法

1)細胞培養:C2C12細胞生長在含10%胎牛血清的DMEM培養基，并置于37℃，體積分數為5% CO2培養箱中，當細胞生長到瓶壁的80%左右時，將所有細胞消化后收集，轉入直徑為3.5 cm的培養皿中，大約培養1 d后，細胞長滿皿底，培養液即換為分化培養液(2%馬血清)，隔天換液1次，分化6 d后進行實驗#65377;

2)刺激方式:采用TY-C型電刺激器電刺激分化6 d的肌管，強度定為45 V 20 ms 5 Hz^[11-12]#65377;對照組不刺激，實驗組刺激時間為15#65380;30#65380;45#65380;60#65380;75#65380;90#65380;105#65380;120#65380;150和180 min#65377;

3)激光照射方式:采用便攜式半導體激光器以連續方式照射，波長810 nm，圓形光斑直徑為3.5 cm，照射時間為10 min#65377;每次照射前后均用功率計(Advantest optical power meter，TQ8210)測量細胞表面的實際功率，其能量密度分別為0.330#65380;1.338#65380;2.646#65380;5.358#65380;8.220#65380;11.220和14.160 J/cm2#65377;

4)ROS的測試:利用熒光探針二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)進行活性氧檢測^[13]#65377;采用原位裝載探針的方法，在37℃細胞培養箱內孵育20 min，然后電刺激和激光處理，用熒光分光光度計檢測，激發波長488 nm，發射波長522 nm#65377;

5)MTT法檢測線粒體的整體功能:用PBS溶液配制MTT(比例為1 mL和5 mg)#65377;實驗處理完畢，吸棄培養皿中的培養液，加入100μL MTT溶液和900 μL PBS，振蕩均勻，放于37℃體積分數為5%CO2培養箱中繼續培養4 h#65377;培養中止后，置于相差顯微鏡下觀察細胞是否被充分染色(蘭紫色)，然后吸棄廢液，加入2 mL的DMSO試劑，充分震蕩5 min，用移液槍移入96孔酶標板中，每孔200 μL(每個實驗組為8孔)#65377;輕輕振蕩15 min，用酶標儀(EL311S，Bio-Tek Instruments)測定吸光度(Absorbance values)，檢測波長為570 nm波長，參考波長為630 nm#65377;

1.3統計處理

實驗數據用SPSS11.0統計軟件包進行統計學處理，各數據以均值±標準差 表示，并進行單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性#65377;

2結果

2.1電刺激對C2C12肌管自由基代謝和線粒體功能的影響

電刺激分化6 d的肌管，ES(electrical stimulation，電刺激)75 min組與對照組比較ROS生成達到一個峰值且有顯著性增加(P<0.01，見表1)，OD值呈顯著性下降(P<0.05，見表2)，且均與ES 60 min組無顯著性差異(P>0.05)#65377;

2.2單純激光照射對肌管自由基代謝和線粒體功能的影響

單純激光照射不經電刺激的肌管，激光照射劑量0.33～14.16 J/cm2時，肌管內ROS生成呈增加趨勢;0.33～2.646 J/cm2劑量與對照組比較差異無顯著性;5.358～14.16 J/cm2劑量與對照組比較差異有極顯著性(見圖1)#65377;激光照射劑量0.33～8.22 J/cm2時，OD值與對照組比較差異無顯著性，11.22～14.16 J/cm2劑量兩組與對照組比較差異顯著性下降(見圖2)#65377;

2.3激光照射對電刺激75 min肌管自由基代謝和線粒體功能的影響

ES+0.33～5.358 J/cm2 LD組與ES 75 min組ROS生成均有所下降，其中ES+0.33 J/cm2 LD組與ES 75 min組比較差異有極顯著性(P<0.01);ES+14.16 J/cm2 LD組與ES75 min組比較顯著性升高(見圖3)#65377;ES+0.33～8.22 J/cm2LD組與ES 75 min組比較OD值均有極顯著性增加，且照射劑量越小效果越明顯(見圖4)#65377;

3討論

3.1細胞模型

劇烈運動可以提高骨骼肌細胞內外空間和血管分隔間的ROS水平，促使線粒體自由基生成增加;骨骼肌可能是體內ROS的重要來源^[14]，而線粒體則被認為是運動時ROS產生的胞內重要部位#65377;ROS的產生與電刺激的電壓強度#65380;刺激頻率和時間有關^[15]，同時許多研究者都認為肌肉收縮時ROS的產生與線粒體活性增加導致的氧耗增加有關^[16]#65377;過高的自由基水平將影響細胞及線粒體功能，并對機體造成一定程度的損傷#65377;研究表明，電刺激C2C12引起其收縮，可以模擬運動時骨骼肌細胞的收縮^[8-9]#65377;在體和離體的肌肉組織都被用來進行ROS生成的研究，但是與培養的骨骼肌細胞不同的是肌肉組織含有內皮細胞#65380;淋巴細胞#65380;成纖維細胞，這些細胞都會產生ROS#65377;因此，很難準確測定骨骼肌細胞收縮所引起的自由基代謝變化的情況，而用培養的細胞則可以解決這一問題#65377;

由不同時間電刺激對肌管ROS代謝的影響的結果可知(見表1)，ROS變化出現雙峰曲線的原因被認為與運動引起的線粒體氧耗變化和細胞的抗氧化系統的調動有很大關系，電刺激75 min時達到一個峰值，此時運動肌氧耗增加，而細胞的抗氧化系統還未被充分調動起來，Na+-K+-ATPase活性變化不明顯^[8];隨著抗氧化系統逐步調動，到90 min時活性氧清除大于生成，ROS生成量迅速降低;在刺激到120 min時抗氧化系統自由基清除的能力跟不上其產生的速率，ROS又出現峰值#65377;本文結果與潘紅英^[8]研究中ROS代謝的趨勢基本相同，但又有差別，原因在于培養肌管的分化時間不同(^[8]文為5 d，本文為6 d)，且ES 75 min組線粒體功能有顯著性下降(P<0.05，見表2)，且均與ES 60 min組無顯著性差異(P>0.05)，因此，為了統一數據，我們選擇ROS生成量的一個峰值ES 75 min建立運動訓練的細胞模型#65377;

3.2細胞康復作用

PBM是單色光或激光(monochromatic light or laser irradiation，LI)對生物系統功能的刺激或抑制作用，不會引起生物系統的損傷#65377;人們研究PBM所使用的LI的強度一般在10 mW/cm2左右，相應的LI先后被稱為低能量LI#65380;低水平LI#65380;低強度LI(low intensity LI，LIL)和低功率LI等#65377;隨著研究的深入，人們發現即使對于強度在102 mW/cm2左右的LI，只要照射時間足夠短，也會產生PBM#65377;人們將這類研究所使用的LI仍然稱為低能量LI或低水平LI#65377;后一種LI的作用機理通常是通過活性氧(ROS)來介導的^[17]，與前一種LI的作用機理明顯不同#65377;鑒于它們在強度上的差異，這里將前一種LI規范稱為LIL，將后一種LI稱為中等強度LI(Moderate intensity LI，MIL)，并將相應的PBM分別稱之為LIL的PBM(PBM of LIL，LPBM)和MIL的PBM(PBM of MIL，MPBM)#65377;當然，對于具體的激光和細胞，低強度和中等強度的范圍會有不同#65377;

由圖2可知，激光照射劑量0.33～8.22 J/cm2時，線粒體功能與對照組差異無顯著性，此劑量段屬于PBM的調節范圍; 11.22和14.16 J/cm2(18.70和23.60 mW/cm2)造成線粒體功能下降，激光已經超出PBM的范圍#65377;由圖1和2，0.33～2.646 J/cm2(0.55#65380;2.23和4.41 mW/cm2)激光照射與對照組ROS無顯著變化，且線粒體功能無變化，說明此時肌管仍處于內穩態，激光屬于低強度范圍#65377;這種情況下，如果肌管遠離內穩態，激光可以促進內穩態的康復(圖3和4所示);5.358和8.22 J/cm2(8.93和13.70 mW/cm2)促進ROS的產生，激光屬于中等強度#65377;這個劑量打破了功能正常的肌管的內穩態，促進了ROS的產生，而此時線粒體功能雖有下降，但無顯著差異#65377;激光對ES 75 min后肌管內ROS的變化趨勢與單純激光照射時大體一致，只是劑量范圍有所不同(如圖3所示)#65377;

由于采用固定照射時間的方法^[18]，從中等強度以上的激光照射所產生的ROS基本上呈線性增加關系(r=0.96，P<0.05)(見圖1):yp=17.895+4.8262x

3.3抗氧化作用

與多數研究都集中在低強度激光抗自由基損傷的間接證據上所不同的是，本研究通過直接測定照射后ROS含量的變化，更直接地說明了低強度激光的自由基清除及產生機制#65377;目前，關于低強度激光照射對機體自由基代謝的作用詳細機制尚未探明#65377;一般認為，低強度激光主要通過光化學作用使抗氧化酶恢復或提高其活性，從而加速自由基的清除，減少過氧化脂質產生#65377;從分子水平來說，低強度激光作用于機體時，光子與機體內的生物分子發生相互作用，生物分子吸收光子的能量并轉化為生物能，在不破壞生物分子的情況下，改變處于失活狀態的抗氧化酶分子的構像，恢復酶的活性，從而提高機體的抗氧化能力，因此在自由基方面即表現為ROS的含量下降或者升高^[19]#65377;

由圖4與圖2對照表明，電刺激后激光的PBM劑量范圍與單純激光照射一樣，0.33～8.22 J/cm2的激光照射對電刺激引起的線粒體功能低下狀態有調理作用，而11.22和14.16 J/cm2造成線粒體功能下降，激光已經超出PBM的范圍#65377;PBM可以恢復線粒體功能，但只有低強度激光抑制ROS產生#65377;其中差異的原因可能與這兩個功能指標的測試有關，細胞內ROS的代謝比較迅速，具有一定的時效性，而激光的作用效應也具有時間效應，因此，對ROS代謝起作用的激光劑量范圍就比較窄;線粒體的檢測需要孵育4 h，這為激光的作用提供了必要的時間條件，因此，對線粒體的功能起調節作用的激光范圍相對比較大一些#65377;其詳細機制還有待進一步探討#65377;

從本實驗的結果可以看出，低強度激光通過提高線粒體內抗氧化酶的活性來增強線粒體功能，進而抑制ROS的產生，促進由電刺激引起的自由基損傷的康復效應#65377;

本研究采用電刺激培養的C2C12作為運動訓練的細胞模型，發現適當劑量的低強度激光照射可以改變氧自由基的代謝速率，其中0.33～5.358 J/cm2的激光照射可以清除部分活性氧，這可能與低強度激光提高機體的抗氧化能力和改變了細胞的氧化-還原狀態有關#65377;因此，我們認為LIL作為一種無損傷的促進運動性疲勞或自由基損傷康復的新型手段，可以用于臨床研究中抑制骨骼肌疲勞#65377;

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[編輯:鄭植友]