周期性牽張應力對人成骨細胞基因表達譜影響的初步研究

[摘要]目的：研究周期性牽張力對人成骨細胞基因表達譜的影響，為進一步研究機械應力狀態(tài)下骨改建機理提供思路和線索。方法：通過體外細胞加載系統(tǒng)對培養(yǎng)的人成骨細胞施加8％形變率、6周/min的周期性牽張力24 h，應用基因表達譜芯片技術對人成骨細胞中的mRNA表達水平進行對比雜交分析，檢測周期性牽張力加載組成骨細胞基因表達譜的變化。結果：在所分析的21 073條人類功能基因中，加載組與未加載組人成骨細胞之間差異表達顯著的基因有2 498條，其中表達上調的有899條(2.0倍以上)，表達下降的有1 599條(0.5倍以下)。這些基因表達產物涉及細胞信號轉導、細胞周期調節(jié)等多個方面。結論：周期性牽張力對成骨細胞多種基因的表達產生了影響，成骨細胞的應力反應是一個復雜的，多基因參與調控的過程。這些變化的基因可能與成骨細胞的機械應力反應有關。

[關鍵詞]周期性牽張應力；人成骨細胞；基因表達譜；基因芯片

[中圖分類號]R783.5 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1410-03

Experimental study of effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts

QIU Jun，LI Yong-ming，LIN Zhu，CHEN Qiao-ling

(Department of Orthodontics，College ofStomatology，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo study effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts in vitro.MethodsHuman osteoblasts were cultured on flexible-bottomed plates and subjected to 8% elongation by strain unit at 6 cycles/min (i.e.5-s elongation and 5-s relaxation) for 24 hours in the experimental groups. Control group were not exerted any strain. Both of them were examined by gene expression profiles chip technology. Results A series of differentially expressed genes were found between experimental group and control group. 899 up-regulated and 1599 down-regulated genes were identified among the 2 498 differentially expressed genes.ConclusionThe results shows that the response ofhuman osteoblasts to cyclic tensile strain in gene level was complicate. These differentially expressed genes are necessary genes related to osteoblasts response to mechanical strain.

Key words:cyclic tensile strain；human osteoblast；gene expression profile； gene chip

成骨細胞(Osteoblast)是一種對應力敏感的細胞，來自多潛能的間充質干細胞，負責骨基質形成及鈣化，在骨改建過程中起重要作用。大量研究表明[1-5]：成骨細胞在應力狀態(tài)下，細胞活力、新陳代謝以及與細胞成骨有關的骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、表皮生長因子受體(epidermal growth receptor，EGFR)、細胞外基質等發(fā)生變化。但是以往的研究多限于一個或幾個分子基因，難以全面系統(tǒng)地了解成骨細胞對機械力刺激的反應模式。因此，本研究利用基因表達譜芯片技術，比較全面地分析牽張應力條件下人成骨細胞功能活性的影響因素，研究周期性牽張力對人成骨細胞基因表達譜的影響，為進一步研究機械應力狀態(tài)下骨改建機理提供思路和線索。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國)；新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；TRIZOL 試劑(Invitrogen，美國)；Agilent 人1A基因表達譜芯片（Agilent，美國）；cRNA擴增與標記試劑盒（Lifegen，美國）；芯片雜交試劑盒（Agilent，美國）；RNA純化試劑盒(Qiage，美國）；芯片掃描儀（Axon 400B，美國）；Genepix3.0軟件(General Scanning，美國)；多通道細胞牽張應力加載儀（第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院）；6孔彈性膜培養(yǎng)板(Flexcell，美國)。

1.2 人成骨細胞培養(yǎng)及鑒定：經(jīng)患者及其家長同意，取一名14歲女性兒童因正畸需要撥除下頜第三磨牙牙胚時去除牙槽骨塊約0.5～1.0g，將組織放于盛少量小牛血清的培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎成約1mm3大小。按酶消化法原代培養(yǎng)人成骨細胞，通過活體觀察、堿性磷酸酶(ALP)染色、骨鈣素免疫組織化學染色法鑒定所培養(yǎng)細胞為成骨細胞，取第5～8代細胞進行實驗。

1.3 加載周期性牽張力：將第5代成骨細胞按1.5×105／孔接種到兩塊6孔彈性膜培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24h，細胞在彈性膜底貼壁牢固，生長至約80%底壁面積，換含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜置24h，再次換含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。其中一塊6孔彈性膜培養(yǎng)板作為實驗組，應用多通道細胞牽張應力加載儀對培養(yǎng)在彈性膜培養(yǎng)板上的成骨細胞施加6周/min、8%形變率的周期性牽張力24h后收集細胞。另一塊6孔彈性膜培養(yǎng)板作為對照組不加載機械力，在相同條件下培養(yǎng)24h后收集細胞。

1.4基因表達譜芯片分析分別取實驗組與對照組人成骨細胞，加適量TRLzol勻漿，離心10min。取上清液加入氯仿，震蕩后放置3min，向上清液中加異丙醇充分混勻再離心10min。加入兩次75%乙醇離心棄上清，加入RNAse-free超純水完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。經(jīng)預雜交后加入逆轉錄引物合成cDNA ，以Cy5標記實驗組細胞cDNA，Cy3標記對照組細胞cDNA做探針，純化后在Agilent Human 1A基因表達譜芯片上進行雜交。沖洗玻片晾干后以Axon 400B掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，用基因圖像分析軟件Genepix3.0對掃描圖像進行數(shù)字化處理和分析。判斷基因差異表達的標準為：①Cy3和Cy5信號比值的自然對數(shù)的絕對值(Ratio)>0.69(基因的表達變化在2倍以上)；②Cy3和Cy5信號值其中之一必須大于800。

2結果

2.1 總RNA提取結果：人成骨細胞總RNA凝膠電泳可見mRNA 18S、28S條帶清晰（如圖1）。紫外分光檢測分析顯示，實驗組與對照組人成骨細胞總RNAOD260/OD280>1.9，說明提取RNA的純度和完整性達到要求。

2.3 基因芯片雜交信號散點圖（如圖3）：分別以參加比對兩組數(shù)據(jù)的對數(shù)值（Ln）作為橫縱坐標作圖，以散點分布趨勢直觀判斷兩組數(shù)據(jù)的差異狀況，沿45°對角線方向分布的基因，表示它在兩樣本中的表達量是相同的。距離對角線垂直距離越遠的基因，表示它在某一樣本中的差異表達程越大。設R=S/ C（S代表縱坐標上歸一化后的樣本數(shù)據(jù)，C代表橫坐標上歸一化后的樣本數(shù)據(jù)），其中紅色的點代表R≥2，即S相對C表達上調大于2倍的基因，綠色的點代表R≤0.5，即S相對C表達下調小于0.5倍的基因，藍色的點表示0.5

1.4 基因表達譜分析結果：在所分析的21 073條人類功能基因中，加載組與未加載組人成骨細胞之間差異表達顯著的基因有2 498條，其中表達上調的有899條(2.0倍以上)，表達下降的有1 599條(0.5倍以下)。按其功能可分為：細胞信號和傳遞蛋白類基因；離子通道和運輸?shù)鞍祝患毎芷谙嚓P基因；DNA結合蛋白、轉錄起始因子；代謝相關的酶和激酶基因；免疫球蛋白基因；細胞受體類基因；DNA合成、修復和重組蛋白類基因；細胞骨架蛋白；其它基因。

3討論

應力作為細胞分子調控的一種刺激因子，是影響細胞結構和功能的重要的外界信息。骨組織為獲得適應現(xiàn)存應力環(huán)境的理想結構，在人的一生中不斷改建重塑。通過成骨細胞與破骨細胞對應力環(huán)境的感受，進行骨基質的有序合成和降解，從而維持骨組織的正常結構和功能。近10年來，雖然有關牽張應力條件下，體外成骨細胞生物學特性變化方面的研究很多，但牽張應力導致成骨細胞生物學行為變化的分子機制尚不清楚。由于生物體是一個復雜的網(wǎng)絡，機械應力對成骨細胞功能的影響是通過多因子多通路的相互作用來控制的，傳統(tǒng)的研究方式難以全面系統(tǒng)地了解成骨細胞對機械力刺激的反應模式。

基因表達譜芯片技術是集分子生物學、細胞遺傳學、生物化學、計算機檢測與分析等多種高新技術為一體的研究手段。其基本原理是通過構建處于某一特定狀態(tài)下的細胞或組織的非偏性cDNA文庫，收集cDNA 序列片段，分析其mRNA群體組成，從而實現(xiàn)對基因表達種類和豐度信息的描繪。基因表達譜從mRNA 水平反映了細胞或組織的特異性表型和表達模式。和其它的基因芯片相比，基因表達譜芯片的反應原理仍然是核酸雜交，所不同的是樣品標記和檢測系統(tǒng)。基因表達譜芯片通過雙色熒光標記，將來源于不同細胞或組織的mRNA在逆轉錄反應中分別用不同顏色的熒光標記成探針，等量混合后與芯片上的基因進行雜交反應，用特有的熒光波長掃描結果芯片，并將掃描所得信號值輸入計算機進行處理，給出每個點在不同波長下的熒光強度值及其比值(Ratio 值)，這些信號就代表了樣品中基因的轉錄表達情況。目前常用的熒光染料是Cy3(綠色)和Cy5(紅色)。如果用Cy3 標記樣本1 mRNA，Cy5 標記樣本2 mRNA，反應后那些在樣本2中呈高表達(或只在樣本2中表達) 的基因其雜交點就會呈現(xiàn)紅色，相反，那些在樣本1中高表達(或只在樣本1中表達) 的基因其雜交點就會呈現(xiàn)綠色， 在兩樣本中表達水平相當?shù)娘@黃色， 而均不表達的則為無色[6-7]。本研究所選Agilent人1A基因表達譜芯片屬于寡核苷酸芯片類型，共包括22 575個樣點，其中覆蓋人類基因21 073個，該基因芯片產品的寡核苷酸探針序列均來自國際公認的Incyte、RefSeq和GenBank數(shù)據(jù)庫。

本研究通過對周期性牽張應力加載前后人成骨細胞內基因表達水平的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)實驗組相對于對照組上調2倍以上的基因有899種，按基因大致功能歸屬分，它們是7種細胞因子、113種酶、21種G蛋白偶聯(lián)受體、8種生長因子、15種離子通道、25種激酶、4種依賴配體細胞核受體、16種肽酶、9種磷酸酶、76種轉錄調節(jié)基因、18種跨膜受體、45種運載體、其它的542種。實驗組相對于對照組下調0.5倍以下的基因有1599種，它們是5種細胞因子、245種酶、8種G蛋白偶聯(lián)受體、4種生長因子、6種離子通道、66種激酶、3種依賴配體細胞核受體、47種肽酶、28種磷酸酶、170種轉錄調節(jié)基因、7種跨膜受體、92種運載體、其它的918種。在這些發(fā)生變化的基因中，包括以往研究較多作用相對清楚的基因，如同源異形盒基因MSX1(Muscle segment homeobox gene)、轉化生長因子-β、骨形成蛋白-2、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF)、某些細胞外基質和相關蛋白及一些細胞粘附分子等基因[8-9]，但大部分參與成骨細胞應力反應的基因的作用和功能并不清楚。

由此可見，機械應力狀態(tài)下人成骨細胞的應力反應調控過程是一個復雜的系統(tǒng)工程，本研究將為進一步研究機械應力狀態(tài)下骨改建機理提供思路和線索。

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[收稿日期]2007-08-14 [修回日期]2007-09-18

編輯/何志斌