瘦素對脂肪細(xì)胞的直接調(diào)節(jié)作用

[摘要]目的：觀察瘦素對人脂肪細(xì)胞分解代謝及脂肪蓄積的直接影響，探討脂肪細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)作用。方法：取正常成人皮下脂肪組織，常規(guī)提取和培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞融合后誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞并隨機(jī)分為四組：正常對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組，分別培養(yǎng)于含瘦素濃度為0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的培養(yǎng)液a中。培養(yǎng)4h后收集培養(yǎng)液檢測游離脂肪酸和甘油濃度，取脂肪細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后圖像分析計(jì)算脂肪顆粒的積分光密度。結(jié)果：與對照組相比，低濃度組培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油濃度分別增加87%（P<0.01）和5%（P<0.01），脂肪顆粒積分光密度減少12%（P<0.01）；中濃度組培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油濃度分別增加181%（P<0.01）和8%（P<0.01），脂肪顆粒光密度減少21%（P<0.01）；高濃度組培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油的濃度分別增加312%（P<0.01）和17%（P<0.01），脂肪顆粒的積分光密度減少35%（P<0.01）。游離脂肪酸和甘油濃度與瘦素濃度呈正相關(guān)，脂肪顆粒積分光密度與瘦素濃度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：瘦素瞬時(shí)作用脂肪細(xì)胞，可促進(jìn)脂肪分解代謝、減少脂肪蓄積；且隨著瘦素濃度增加，作用更強(qiáng)，呈劑量依賴性。瘦素對脂肪細(xì)胞存在自分泌調(diào)節(jié)作用，可能在肥胖發(fā)病機(jī)制中起重要作用。[關(guān)鍵詞]瘦素；脂肪細(xì)胞；自分泌

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1346-03

The direct effect of leptin on adipocyte

WU Guo-hui1，ZHAO Feng1，YUAN Keng2，LI Xiao-lin1

(1.Department of Plastic Oral Maxillofacial Surgery， Jiangxi Provincial People's Hospital， Nanchang 330006， Jiangxi， China;2.Department of Tumour， Jiangxi Provincial Research Insititute of Medical Sciences)

Abstract:ObjectiveTo investigate the direct effect of leptin on lipolysis and lipopexia of human adipocyte， and to explore the autocrine regulation of adipocyte. MethodsSubcutaneous fatty tissue of adult normal were prepared， then preadipocyte were cultured and induced to differentiate. After identified by oil red staining， adipocyte were divided randomly into four groups， i.e. normal control group， low concentration group， media concentration group and high concentration group， in which the concentration of lepin were 0ng/ml， 10ng/ml， 100ng/ml， 1000ng/ml respectively. Media from the four groups were collected after cultured 4h to detect the concentration of free fatty acid and glycerol， and meanwhile the cells were stained by oil red and evaluated the content of lipochondria. ResultsCompared with normal control group， the concentration of free fatty acid and glycerol were increased 87%， 5%(P<0.01) respectively in low. concentration group， and up-regulated 312%(P<0.01)， 17%(P<0.01) respectively in high concentration group. Meanwhile， the integral optical density(IOD) of lipochondria was decreased 12%(P<0.01) in low. concentration group， and down-regulated 35%(P<0.01) in high concentration group. In addition， the concentration of free fatty acid and glycerol were positive correlated with the dose of letin， but the IOD of lipochondria negative correlated with it.ConclusionThere is transient action of lepin on adipocyte， which is positive correlation with the concentration of leptin and was found to promote the lipolysis of adipocyte and reduce the accumulation of fat. The autocrine regulation of adipocyte may be important for obesity.

Key words: lepin; adipocyte; autocrine

肥胖癥日益成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人們身心健康的疾病，同時(shí)它又是多種疾患包括心血管疾病、糖尿病等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。脂肪細(xì)胞體積的增大和數(shù)量的增多是肥胖癥發(fā)生發(fā)展的直接原因。脂肪細(xì)胞中脂肪分解與合成之間的失衡導(dǎo)致能量代謝紊亂，可能引起脂肪蓄積過多、脂肪細(xì)胞中脂滴含量增加，從而產(chǎn)生肥胖。許多因素可以影響脂肪細(xì)胞代謝，包括：激素、生長因子、藥物等[1-3]。

瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的激素，具有廣泛的生物學(xué)作用，瘦素的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是肥胖研究中的里程碑。隨著瘦素受體在眾多外周細(xì)胞表面的發(fā)現(xiàn)[4]，瘦素的直接外周作用受到越來越多的關(guān)注。RT-PCR和凝膠移位分析都已經(jīng)證實(shí)脂肪細(xì)胞表面存在瘦素受體[5]，提示瘦素可能直接影響脂肪細(xì)胞的脂肪含量，調(diào)節(jié)肥胖發(fā)生。

1材料和方法

1.1材料：無內(nèi)分泌及代謝性疾病的成人上腹部皮下脂肪組織，重組人瘦素（Pepro TechUSA），膠原酶IV（Gibco USA），轉(zhuǎn)鐵蛋白、生物素、泛酸鈣、胰島素（Sigma USA），脂肪酸和甘油試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）等。

1.2 培養(yǎng)液的配制：①培養(yǎng)液a：DMEM/F12（1∶1）混合培養(yǎng)液（含10%FBS、33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸鹽、10萬IU/L青霉素和100mg/L鏈霉素）；②培養(yǎng)液b：DMEM/F12（1∶1）混合培養(yǎng)液（含33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸鹽、10萬IU/L青霉素和100mg/L鏈霉素，5mg/L 胰島素、10mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、10μg/L bFGF）

1.3 人前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人前脂肪細(xì)胞：切取人上腹部皮下脂肪組織，DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)浸泡脂肪組織10min，剔除肉眼可見的血管和筋膜等其他組織；Hank’s液(含100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)沖洗3遍后移入無菌的三角燒瓶，眼科剪剪成直徑約1mm的小組織塊，加入0.2%膠原酶IV 37℃水浴消化10min，含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。100目、200目不銹鋼篩網(wǎng)先后過濾，取細(xì)胞懸液，離心（1 700rpm 10min）后棄上清；加入0.16mol/L NH4Cl作用10min，Hank’s液（含100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素）洗滌2次后離心（1 700rpm10min），棄上清。培養(yǎng)液a懸浮細(xì)胞，按1×105個(gè)/ml濃度接種于12孔板，置37℃、5%CO₂培養(yǎng)。每日觀察，每2天換液一次。

1.4 前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)

1.4.1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)：參考目前常用誘導(dǎo)方法[6-7]，待前脂肪細(xì)胞生長融合后，PBS洗滌細(xì)胞2次，用無血清的培養(yǎng)液b于37℃、5%CO₂誘導(dǎo)培養(yǎng)。每天觀察，每2天換液一次。誘導(dǎo)培養(yǎng)一周后行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 脂肪細(xì)胞鑒定：稱量1.4g油紅O充分溶解于400ml異丙醇，室溫靜置過夜，過濾后為貯存液，避光保存。工作液按3倍體積貯存液加入2倍體積蒸餾水臨時(shí)配制。

油紅O染色：吸去培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，10%甲醛固定30min，滴入2ml油紅O工作液浸染15min。棄油紅O工作液，PBS漂洗1次，光鏡下觀察。1.5 脂肪細(xì)胞分組：脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，培養(yǎng)液a培養(yǎng)于37OC、5%CO₂。隨機(jī)分為四組：正常對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，接種于12孔板，每組10孔。培養(yǎng)液中瘦素終濃度正常對照組0ng/ml，低濃度組10ng/ml，中濃度組100ng/ml，高濃度組1 000ng/ml。培養(yǎng)4h后取各組培養(yǎng)液按試劑盒說明檢測游離脂肪酸和甘油濃度。收集脂肪細(xì)胞行油紅O染色，拍照后圖像分析。

1.6培養(yǎng)液中游離脂肪酸濃度檢測：按試劑盒步驟檢測各組培養(yǎng)液中游離脂肪酸濃度。游離脂肪酸經(jīng)過有機(jī)抽提和銅皂化，進(jìn)行顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定546nm OD值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離脂肪酸濃度。

1.7 測定培養(yǎng)液中甘油濃度：采用GPO Trinder酶學(xué)反應(yīng)，操作按試劑盒說明進(jìn)行，最后用分光光度計(jì)在505nm波長測定各組OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘油濃度。

1.8 脂肪細(xì)胞中脂肪顆粒積分光密度測定：收集各組脂肪細(xì)胞行油紅O染色，然后沿各孔垂直、水平徑在光鏡下對染色后的細(xì)胞進(jìn)行拍照，每孔9張。應(yīng)用Image-pro plus圖像分析軟件測定脂肪細(xì)胞中脂肪顆粒的積分光密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析，組間參數(shù)兩兩比較行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 人前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)觀察：細(xì)胞接種后可見大量漂浮的圓形細(xì)胞，24h后大部分細(xì)胞貼壁。初期細(xì)胞體積小，呈紡錘形或梭形，核漿比例大，仍有少數(shù)細(xì)胞未帖壁；換液后懸浮細(xì)胞漸被棄去，剩下貼壁生長的前脂肪細(xì)胞。7天左右細(xì)胞生長至融合，核漿比例減小，部分可見核分裂相（圖1）。

2.2 前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化和鑒定：加入無血清的培養(yǎng)液b后，前脂肪細(xì)胞停止增殖，形態(tài)由紡錘形或梭形逐漸膨脹，變成橢圓形和圓形，體積增大。48h后細(xì)胞內(nèi)可以觀察到圓形顆粒，顆粒每日增多，一周后達(dá)到高峰。細(xì)胞膜出現(xiàn)皺折，輪廓變淡。此時(shí)行油紅O染色，可見大小不等的橘紅色脂肪顆粒(圖2)。

2.3各組游離脂肪酸及甘油濃度、脂肪顆粒積分光密度的檢測，見表1。

瘦素作用4h后，各組培養(yǎng)液中游離脂肪酸、甘油濃度及脂肪細(xì)胞脂肪顆粒積分光密度檢測結(jié)果如表1所示。與正常對照組相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組游離脂肪酸、甘油濃度均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；脂肪細(xì)胞脂肪顆粒積分光密度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中高濃度組差異最明顯，培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油濃度較對照組分別增加約312%（P<0.01）和17%（P<0.01），脂肪顆粒積分光密度較對照組減少約35%（P<0.01）。培養(yǎng)液中游離脂肪酸、甘油濃度與瘦素濃度正相關(guān)，脂肪細(xì)胞脂肪顆粒積分光密度與瘦素濃度負(fù)相關(guān)。

3討論

肥胖嚴(yán)重危害人們身心健康及形體美，是體形塑造的主要內(nèi)容之一，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響健康的第五大危險(xiǎn)因素；另外，肥胖導(dǎo)致的心腦血管疾病、糖尿病等已成為主要的健康危害因素。預(yù)防和控制肥胖已成為刻不容緩的任務(wù)，但各類治療方法均存在一定的局限性，肥胖發(fā)病機(jī)制不明極大地制約了其臨床防治。

以往肥胖發(fā)病機(jī)制的研究主要集中于觀察瘦素的中樞調(diào)節(jié)作用，對瘦素-下丘腦調(diào)節(jié)通路的報(bào)道甚多。嚙齒類動物服用瘦素可以減少脂肪含量；許多研究證明瘦素引起的脂解作用是使脂肪組織從增生到衰減的一個(gè)重要原因，給小鼠注射瘦素會導(dǎo)致其基礎(chǔ)的脂解作用明顯增加[8-9]。瘦素在肥胖發(fā)病機(jī)制中的重要作用得到公認(rèn)。近年來，瘦素受體被發(fā)現(xiàn)存在于外周多種細(xì)胞，瘦素的外周直接調(diào)節(jié)作用逐漸受到廣泛關(guān)注。功能性瘦素受體在脂肪細(xì)胞的存在提示瘦素外周自分泌調(diào)節(jié)的可能。為此，我們體外觀察了瘦素瞬時(shí)作用脂肪細(xì)胞后，對脂肪細(xì)胞分解代謝和脂肪蓄積的影響，初步探討瘦素對脂肪細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)作用。

本研究中觀察了瘦素對脂肪細(xì)胞分解代謝的瞬時(shí)作用，脂肪細(xì)胞在4h內(nèi)還不足以完成從轉(zhuǎn)錄、翻譯到翻譯后合成自分泌肽這一過程，觀察瘦素作用4h后的脂肪細(xì)胞變化可以了解瘦素對脂肪細(xì)胞代謝的直接調(diào)節(jié)作用[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瘦素明顯增加人脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油含量，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分解代謝；減少脂肪細(xì)胞中脂肪顆粒、脂肪蓄積。并且隨著瘦素濃度增加，作用更強(qiáng)。高濃度組瘦素對脂肪細(xì)胞的分解代謝具有最大的刺激效應(yīng)，培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油的濃度最高，與之相對應(yīng)的是脂肪細(xì)胞中脂肪顆粒的積分光密度最低；提示瘦素對脂肪細(xì)胞具有直接調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)脂肪分解代謝、減少脂肪蓄積，且該作用存在劑量依賴性。以往研究結(jié)果和我們觀察相一致， Ramsay1998年[10]實(shí)驗(yàn)證實(shí)瘦素能影響豬脂肪細(xì)胞代謝，而且10ng/ml是可以引起脂肪細(xì)胞代謝發(fā)生變化的最小濃度。Fruhbeck G等[9]體外觀察了瘦素對不同種類脂肪細(xì)胞脂解作用的影響，發(fā)現(xiàn)瘦素可以增加消瘦小鼠脂肪細(xì)胞的脂解活性，瘦素對瘦素表達(dá)障礙小鼠ob/ob小鼠脂肪細(xì)胞脂解活性的刺激效應(yīng)更加明顯，并且ob/ob小鼠脂肪細(xì)胞脂解活性隨瘦素濃度的增加而增強(qiáng)，而消瘦小鼠脂肪細(xì)胞的脂解活性對瘦素沒有劑量依賴性；與消瘦小鼠和ob/ob小鼠相反，瘦素對瘦素受體基因發(fā)生突變的db/db小鼠脂肪細(xì)胞的脂解活性沒有刺激作用。提示了瘦素直接調(diào)節(jié)作用的存在，且該調(diào)節(jié)作用可能是瘦素受體依賴的。

本研究在瘦素作用4h后檢測了培養(yǎng)液中游離脂肪酸和甘油濃度、脂肪細(xì)胞中脂肪顆粒的積分光密度，觀察了瘦素對脂肪細(xì)胞的瞬時(shí)直接調(diào)節(jié)作用；發(fā)現(xiàn)瘦素能直接調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分解代謝、影響脂肪蓄積，并且該調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴性，這可能在肥胖發(fā)病機(jī)制中起重要作用；為進(jìn)一步探討脂肪細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)通路及其在肥胖發(fā)生中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿日期]2007-06-15 [修回日期]2007-09-02

編輯/張惠娟