人表皮干細胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定

[摘要]目的：探討人表皮干細胞的體外快速分離培養(yǎng)及鑒定方法。方法：中性蛋白酶和胰蛋白酶兩步法從手術切除的人包皮組織中分離表皮層和真皮層，并獲得表皮單細胞懸液，采用Ⅳ型膠原鋪板選擇性粘附、分離和角質形成細胞無血清培養(yǎng)基（K-SFM）培養(yǎng)表皮干細胞。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的生長狀況，檢測細胞克隆形成率，免疫組化染色觀察表皮干細胞標志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表達；以角質形成細胞作為對照。結果：組織學觀察顯示，培養(yǎng)24h后細胞呈克隆狀生長;所分離、培養(yǎng)細胞的克隆形成率高于對照角質形成細胞組;免疫組化染色顯示，培養(yǎng)細胞β1整合素及Kl9均呈陽性表達。結論：運用Ⅳ型膠原粘附結合K-SFM培養(yǎng)可以實現(xiàn)人表皮干細胞的體外快速分離和培養(yǎng)。

[關鍵詞]表皮干細胞；細胞培養(yǎng)；細胞分離；鑒定

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1343-03

Isolation，culture and identification of hmnan epithelial stem cells

LI Dan，LI Shi-rong，CAO Chuan

（Department of Cosmetic Surgery，Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

Abstract: ObjectiveTo explore a method for isolation and culture of human epidermal stem cells. MethodsThe Epidermal stem cell were isolated byadhering to collagen type IV after obtained by digesting human foreskin with Dispase Ⅱ and Tryp and culture in vitro in K-SFM. The expressions of β1-integrin and keratin 19 (K19) in epidermal stem cell were detected with immunocytochemical methods，and the colony forming efficiency was also studied .Keratinocytes were served also detected. Results It was revealed by histological observation that colonieswere formed 24 hours after inoculation. The isolated and cultured cell cloning efficiency was higher than that of the control group. Positive expression of β1-integrin and K19 of cultured cells was detected by immunocytochemistry. ConclusionAdult epidermal stem cells could be successfully isolated and cultured by adhension with type Ⅳ collagen and culture with K-SFM

Key words：epidermal stem cells;cell culture;cell isolation;identification

皮膚作為人體最大的器官，外層的表皮終身不斷自我更新。這種更新由表皮基底層具有再生能力的角質形成細胞分裂、增殖、分化來完成。皮膚角質形成細胞主要包括表皮干細胞(epidermal stem cell，ESC)、短暫擴增細胞(transit Amplifying cell，TA cell)及終末分化細胞(postmitotic differentiating cell，PMD cell)[2]。其中，位于基底部的表皮干細胞持續(xù)增殖分化以取代外層終末分化細胞。從而在維持組織結構的更新、細胞內環(huán)境的穩(wěn)定和創(chuàng)傷后創(chuàng)面修復過程中起著至關重要的作用，但由于ESC 數(shù)量較少(只占基底細胞總數(shù)的1%～10%[1])，缺乏明確的特異性分子標志，體外培養(yǎng)很容易丟失其干細胞生物學特性，因而如何大量獲得純度較高的表皮干細胞即成為目前干細胞研究領域的熱點。本研究利用酶消化法和IV膠原篩選貼壁對人包皮表皮干細胞進行分離和純化，以期為進一步研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1 角質細胞無血清培養(yǎng)基(SFM-KC)（美國Gibco公司），Dispease酶（美國Gibco公司），人胎盤IV型膠原（美國Sigma公司），胰蛋白酶、小鼠抗人角蛋白19、小鼠抗人Bl整合素，PowerVisionTM二步法免疫組織化學檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.2 標本采集與處理：包皮皮片來自本院泌尿外科包皮環(huán)切術患者，無泌尿系統(tǒng)疾病感染。患者年齡5～25歲，所取皮片均得到患者知情同意。

1.3 試劑制備：①K-SFM的配制：500mlK-SFM加入1ml培養(yǎng)基添加劑，分裝后4℃保存?zhèn)溆茫虎谥行缘鞍姿饷傅呐渲疲褐行缘鞍姿饷?5mg，用D-Hanks溶解定容至100ml，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆茫虎邰粜湍z原包被培養(yǎng)瓶及細胞爬片的制備：Ⅳ型膠原溶于體積分數(shù)為0.1％ 的醋酸溶液至終濃度為100mg／L，濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆谩＜毎N壁培養(yǎng)前30min用配制好的Ⅳ型膠原溶液l～2ml平鋪于25cm 培養(yǎng)瓶中及已經(jīng)放入蓋玻片的12孔板內。

1.4 表皮干細胞的分離與培養(yǎng)：無菌條件下去除皮下脂肪層，用含青霉素、鏈霉素的PBS反復沖洗皮片5次，修剪為大小約0.5cm×1cm的皮片，中性蛋白酶4℃消化l4～16h，吸棄上清，分離表皮和真皮層。剪碎表皮，0.25％的胰蛋白酶37℃消化15min，加入含有10％小牛血清的DMEM終止消化，吹打至懸，200目篩網(wǎng)研磨濾過。濾液經(jīng)離心1 000r/min，5min收集細胞。棄上清，加入K-SFM并輕柔吹打制成單細胞懸液，一部分接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶及12孔板內作為實驗組，另取部分細胞懸液直接接種于未鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶內，作為對照組；37℃孵育15min。倒置顯微鏡下觀察，實驗組粘附在Ⅳ型膠原被膜上的細胞則主要為表皮干細胞，吸出細胞懸液，加入K-SFM，置于37℃、5%CO₂ 孵箱培養(yǎng)。次日，吸出培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，加入K-SFM，37℃ 5％CO₂，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每2天換液1次，光鏡下觀察細胞生長及爬片情況。

1.5 表皮干細胞的傳代：當細胞接近70％～80％融和時，0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化培養(yǎng)瓶內細胞，按1：1.5傳代。傳代細胞接種于IV型膠原預鋪的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。

1.6 細胞鑒定

1.6.1 細胞克隆形成率測定：細胞克隆形成率測定：取第2 代表皮干細胞及角質細胞，制備單細胞懸液，按200個細胞/孔接種于6 孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)2周后對細胞進行克隆計數(shù)并計算克隆形成率（CFE），其公式為CFE=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。以角質細胞作對照。

1.6.2 細胞表面標志物的鑒定：免疫細胞化學染色：取原代細胞爬片，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30min，二步免疫組化檢測法分別行細胞K19和β1整合素免疫細胞化學染色；同時用PBS代替一抗作空白對照。

1.6.3 統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件行t檢驗。

2結果

2.1 培養(yǎng)細胞的生物學特性：篩選后貼壁的表皮干細胞于倒置相差顯微鏡下觀察，細胞均勻分散，呈圓形，胞體小，折光性強；24h后細胞略伸展為扁平的三角形或多邊形；3天后，有部分細胞形成較小克隆，包體緊密相靠，包膜互相銜接，呈典型“鋪路石樣”生長，繼續(xù)培養(yǎng)，克隆逐漸擴大部分中央會出現(xiàn)細胞復層生長（圖1～3）。

2.2 表皮干細胞的克隆形成率：表皮干細胞與角質形成合細胞相比，增殖速度相對較慢，但所形成的克隆大于后者。原代表皮干細胞融合時間約14～18天，同代角質細胞在8～10天即可融合。

2.3 免疫細胞化學染色：β1整合素、K19免疫細胞化學染色均在細胞胞漿內出現(xiàn)，呈棕黃色著色的陽性表達（圖4a、4b，圖5a、5b）

3討論

表皮層由深層至表面分為基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質層，代表了表皮干細胞分化和成熟的不同階段。基底層的表皮干細胞分化為短暫擴充細胞，并由其繼續(xù)增殖、分化為終末分化細胞，最終角化由表皮脫落，完成正常皮膚的新成代謝過程；不僅如此，表皮干細胞還積極參與皮膚損傷后的修復，是皮膚發(fā)生、修復和重塑的關鍵性源泉[12-13]。表皮干細胞具有慢周期性，體外培養(yǎng)時有較高的克隆形成率，自我更新能力強，與皮膚基底膜粘附緊密等特點[9]。目前，表皮干細胞的分選有兩種方法，利用公認的細胞表面標志物，制備單克隆抗體，用流式細胞儀或免疫磁株進行篩選[11]；或利用表皮干細胞對Ⅳ型膠原的快速粘附能力進行篩選。前者分選的精度較高，陽性細胞率大，但分選后細胞活性會受影響，且實驗成本較高；后者分選的精度較低，但細胞生長良好，方法簡單易行。Bickenback等[10]報道，37℃孵育10～20min后表皮干細胞可在I型膠原、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等基質上粘附，但只在Ⅳ型膠原上生長良好，利用其他基底層細胞粘附慢的特性可將表皮干細胞初步分離并進行培養(yǎng)。本試驗即選用細胞外基質成分Ⅳ 型膠原分選表皮干細胞，觀察到表皮細胞接種15min后，實驗組細胞貼壁較為分散，數(shù)目較多；對照組貼壁細胞數(shù)較少。孵育24h后，實驗組細胞80％已伸展偽足，少量細胞脫壁懸浮，對照組細胞伸展不明顯，脫壁細胞較多。孵育72h后，實驗組個別細胞形成較小克隆，貼壁牢固，換液后細胞脫落不明顯，而對照組未見明顯克隆形成，細胞貼壁不牢，換液后細胞脫落較多。表皮干細胞這種對Ⅳ 型膠原依賴性，可以較好的解釋細胞外基質成分對細胞的粘附、生長、移行等方面起著重要的作用[14]。實驗中，還采用了限定性角質形成細胞培養(yǎng)基K-SFM，應用無血清培養(yǎng)技術可以排除血清中許多未知因素對干細胞分化的影響。

鑒定表皮干細胞的關鍵是要找到特異的細胞表面標志物。研究表明，表皮細胞能夠表達多種粘附分子，包括α2β1、α3β1、α5β1、α6β4及αγβ5 等，這些粘附分子不僅介導著細胞與細胞外基質的結合，同時也調控著細胞的分化程度[15]。β1整合素不僅介導表皮干細胞與細胞外基質的黏附，也調控終末分化啟動。有實驗證實，β1整合素表達的降低會刺激角質干細胞離開干細胞池，向上遷移成為分化細胞[16-18]，因而認為β1整合素高表達可以是表皮干細胞的標志物之一 。在非整合素的表面標記中，研究較多的是細胞角蛋白家族里的一些成員。角蛋白是表皮干細胞的結構蛋白，能較精細地反映細胞的增殖、分化狀態(tài)。K19表達陽性的細胞多位于毛囊隆突區(qū)和表皮基底層，該部位都是公認的表皮干細胞分布區(qū)域；且具有干細胞的慢周期性和強大的增殖特性。而終末分化細胞則表達K10。所以K19被認為是表皮干細胞的另一種表面標志[19]。

綜上所述，目前關于表皮干細胞的培養(yǎng)及分離技術已經(jīng)取得了很大的突破，但仍有很多問題有待進一步解決；如表皮干細胞的特異性標志物仍未能完全確定；如何確保體外培養(yǎng)的表皮干細胞穩(wěn)定的生物學特性；構建完整可用的皮膚所需時間仍較長，且移植后的療效仍不理想。故而，更多的研究仍需進一步的開展，為表皮干細胞更好地臨床應用提供可靠的理論基礎。

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[收稿日期]2007-08-05[修回日期]2007-10-15

編輯/張惠娟