濕熱型潰瘍性結腸炎造模方法的實驗研究

　　摘要：目的：復制濕熱型潰瘍性結腸炎大鼠模型，探討該模型的客觀指標評價體系。方法：采用高脂高糖飲食造成濕熱體質，用三硝基苯磺酸(7NBS)和乙醇混合液灌腸誘發濕熱型潰瘍性結腸炎，觀察大鼠證候、結腸病理學改變及血清白介素－6(IL－6)。結果：模型大鼠出現粘液便、懶動、食欲減退等濕熱證候，病理切片可見結腸粘膜出現明顯潰瘍、病理學評分有顯著性差異(P＜0.01)，血清IL－6明顯升高(P＜0.01)。結論：采用飲食加化學刺激法首次成功復制出濕熱型潰瘍性結腸炎的大鼠模型，并擬定證候、病理及免疫三大指標體系。可為臨床和實驗研究提供參考。
　　關鍵詞：濕熱證；潰瘍性結腸炎；模型；白介素－6
　　中圖分類號：R285.5　文獻標識碼：A
　　文章編號：1007－2349(2007)11－0037－03
　　
　　潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是臨床引起腹瀉的常見病和難治病，其辨證分型以濕熱型最常見，但在該病的造模實驗研究當中，目前只復制出肝郁脾虛和脾虛兩種動物模型，尚未復制出最常見的濕熱型動物模型，更未能建立該模型的客觀指標評價體系。基于上述問題，本研究運用中醫的病因病機理論及潰瘍性結腸炎的西醫發病機制學說，采用飲食加化學刺激的方法，首次成功復制出濕熱型潰瘍性結腸炎的大鼠模，并初步擬定了客觀指標評價體系，為臨床和實驗研究提供成熟的動物模型。具體實驗情況如下。
　　
　　1 材料與方法
　　
　　1．1 材料
　　1．1．1 實驗動物 36只3月齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)購自廣東實驗動物中心，動物合格證編號：2006A027。
　　1．1．2 試劑及物品 三硝基苯磺酸由美國Sigma公司生產，批號：026K5006。大鼠血清IL－6(EIJSA法檢測)試劑盒由美國California R&B公司生產。紅星二鍋頭(酒精度為56°)為北京紅星股份有限公司產品；蜂蜜由海南卓灃蜂業有限公司生產。
　　1．1．3 儀器 EPICS公司高速離心機(HERAEUS－1.0R)，電子天平為上海臺之衡電子衡器有限公司產品，酶標儀由Bio－Tek公司生產。
　　1．2 造模方法 采用高脂高糖飲食加化學刺激法。隨機選取9只大鼠為空白對照組，普通飼料喂養，自由飲水。其余27只為造模組(其中18只另分別作治療和對照組，此文暫不討論)，以普通飼料喂養為基礎，自由飲用濃度為200s／L的蜜糖水，每日上午灌服豬油lOg／ks，約30min后再灌服56度白酒(紅星二鍋頭)10ml／k8，共持續10天，以造成內因濕熱模型；于造模第11天禁食24h，用3％戊巴比妥鈉30rag／k8腹腔注射麻醉，予三硝基苯磺酸(TNBs)lOOmg／k8(約等于TNBs原液0.20ml／100g)加50％乙醇0.25ml，用直徑約1.5mm的聚丙烯管插入肛門上段約8cm后一次性注入上述混合試劑。造出濕熱型潰瘍性結腸炎大鼠模型。
　　1．3 觀察指標
　　1．3．1 一般情況 泄瀉程度、大便的性狀、顏色、氣味、精神狀態、飲食量、毛發等，計算24h濕糞重量和記錄體重。
　　1．3．2 評分 肉眼觀察結腸組織形態學改變并按表1進行評分。
　　1．3．3 血清 IL－6檢測。
　　1．3．4 病理切片 觀察結腸病理改變。結果見表l。
　　
　　1．4 標本處理和指標檢測
　　1．4．1 血標本 造模后觀察72h，確定模型穩定，用ELISA法檢測空白及模型組大鼠血清IL－6含量，結果用ng／L表示。
　　1．4．2 結腸標本 頸椎脫臼處死大鼠，剖腹取距離肛門約8cm結腸一段做HE染色。
　　1．4．3 糞便 用鼠籠收集大鼠24h濕糞，用電子天平稱取濕糞重量。
　　1．5 統計方法 采用t檢驗。
　　
　　2 結果
　　
　　2．1 證候 濕熱造模期間部分大鼠出現短時間站立不穩、呼吸加快的醉酒表現，飲食量和體重下降，且出現最具特征性的粘液便，常為兩節糞便由一絲狀粘液連結，不易拉斷(圖1)；糞便的顏色及穢味加深加重。灌腸造成潰瘍性結腸炎模型后，大鼠腹瀉明顯，24h濕糞重量見表2。其中部分大鼠出現明顯中毒性結腸擴張和腸粘連(圖2及圖3)。
　　
　　
　　2．2 病理學檢查 模型組大鼠結腸粘膜出現明顯充血水腫，可見多個潰瘍灶，大量炎癥細胞浸潤，HE染色切片8/vv8Tg8fB+UcePqsW/02A==見圖4，評分見表2。
　　2．3 免疫學檢查 血清IL－6明顯升高，見表2。
　　
　　
　　3 討論
　　
　　3．1 造模結果評價 IL－6是組織損傷后產生的一種重要細胞因子，具有免疫調節作用，它與炎癥的發生發展有密切聯系。在濕熱證本質的研究中發現IL－6與濕熱的發生存在重要關系，故本研究選取IL－6作為濕熱的評價標準。大鼠出現絲狀粘液便、懶動、食欲及體重下降等表現，符合中醫理論“濕性粘滯、重濁、趨下”等特點。本研究發現造模后IL－6顯著升高，且部分大鼠出現中毒性結腸擴張、腸粘連等UC的嚴重并發癥，結合證候及病理學檢查，證實濕熱型潰瘍性結腸炎的造模方法成功，且該模型穩定性理想。
　　3．2 造模方法概述及評價 1984年Morris采用三硝基苯磺酸(TNtks)與乙醇混合液灌腸成功復制出UC的大鼠模型，此方法后來被廣泛參考和采用。當前UC的造模方法主要分4類：化學性刺激法，主要是用三硝基苯磺酸、葡聚糖硫酸鈉、乙酸等灌腸造模，免疫學方法，主要有大鼠結腸細菌株模型、胎鼠結腸包埋法等；復合法，主要是將兩種化學方法進行結合；中醫方面的造模方法目前只復制出肝郁脾虛及脾虛兩種證型的UC模型，尚未復制出最常見的濕熱型UC模型，且上述研究均沒有為特定證型的UC制定系統客觀的指標評價標準體系。
　　3．3 濕熱型潰瘍性結腸炎模型的客觀指標評價體系 該模型是西醫疾病與特定中醫證型結合起來的模型。故應“同時具備濕熱證和潰瘍性結腸炎的客觀指標”。根據UC的免疫學發病機制。結合濕熱證本質與免疫的關系，本研究擬定了以下濕熱型UC的客觀指標評價體系：
　　3．3．1 濕熱證候指標 糞便出現明顯粘液，黃色加深、味穢，排便次數增多且不易排盡而易粘附于肛周；食欲下降、懶動、毛發失榮、對刺激反應下降，體重減輕等。
　　3．3．2 病理學指標 病理切片和評分。
　　3．3．3 免疫學指標 如白介素、抗中性粒細胞抗體等。
　　3．4 本造模方法的細節及要點探討
　　3．4．1　防止灌腸液流出 灌腸后腸腔壓力增加且在麻醉狀態下進行操作，肛門處于松弛狀態，所以拔管后灌腸液容易流出肛門，故應該采取以下措施避免：拔管前后使大鼠處于頭朝下、肛門朝上的體位；緩慢拔管后，按壓肛門至少2min。
　　3．4．2 麻醉藥及其劑量選擇 因為該實驗要求動物術中無掙扎且在術后蘇醒，故應選取起效快且作用時間不宜過長的麻醉藥。烏拉坦雖然起效快，但術后蘇醒需要的時間過長，且麻醉過程中死亡率較高；乙醚起效快，但術中動物易蘇醒不能配合手術。故3％戊巴比妥鈉是最理想的麻藥。術中發現若按0.1ml／100g的劑量，部分大鼠麻醉效果欠佳，追加到0.12ml／100g則麻醉效果理想，且動物可在術后3h內全部蘇