丹參納米銀復合材料的生物安全性研究

[摘要]目的：研究丹參納米銀復合材料(salvia M．1tiorrhiza/Naflo-silver composite)的生物安全性。方法：通過無菌試驗、熱原試驗、皮膚刺激試驗、皮內刺激試驗、全身急性毒性試驗及SD大鼠對該材料中銀的吸收、代謝情況對自制的丹參納米銀復合材料進行生物安全性評價。結果：丹參納米銀復合材料無菌、無熱原、無刺激、無明顯急性毒性，且機體對納米銀的吸收比對經典創面抗感染藥磺胺嘧啶銀少。結論：丹參納米銀復合材料作為創面修復材料具有良好的生物安全性。

[關鍵詞]丹參；納米銀；磺胺嘧啶銀；無菌；熱原；刺激作用；全身急性毒性

[中圖分類號]R644 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)05－0596－04

在金屬納米材料中，銀以其獨特的抗菌性能而在醫學界得到廣泛應用，特別是在大量抗生素耐藥的今天。而納米銀使銀的殺菌能力產生了質的飛躍。因此，在燒傷整形領域出現越來越多的含納米銀的新敷料。一種新的醫用生物材料應用于臨床前需對其進行安全性評價。因此，本研究對自制的丹參納米銀復合材料進行了無菌試驗、熱原試驗、原發性皮膚刺激試驗、皮內刺激試驗、急性全身毒性試驗及測定全血及組織中的痕量銀以評價該材料的生物安全性，為其作為創面修復和種子細胞的支架材料提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑：HS－1300超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；101AB－Z電熱恒溫熱鼓風干燥箱(上海華聯環境試驗設備公司恒昌儀器廠)；XW－80A旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠)；銀元素空心陰極燈；360MC型原子吸收分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

丹參注射液(江蘇安格藥業有限公司，生產批號：061205D)；粉狀殼聚糖(浙江玉環化工廠，脫乙酰度90％以上)；冰醋酸(99.5％)，硝酸銀，氫氧化鈉，檸檬酸三鈉等均為分析純；8％硫化鈉溶液，3％戊巴比妥鈉。

1.2 實驗動物：1.9～2.8kg家兔，17～23g健康小白鼠，0.2kg左右SD大鼠，由南通大學實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 丹參納米銀復合材料的制備

1.3.1.1 納米銀的制備：根據Meisel報道的方法制備納米銀。

1.3.1.2 殼聚糖膜的制備：用1％冰醋酸溶液溶解殼聚糖得到1.5％的殼聚糖溶液。過濾后倒入塑料培養皿中烘干成膜。

1.3.1.3 丹參納米銀復合材料的制備：通過自組裝技術得到丹參納米銀復合材料。

1.3.2 無菌試驗：根據中華人民共和國藥典(二部，2005)附錄XIH進行無菌試驗。

1.3.3熱原試驗

1.3.3.1 浸提液的制備：將丹參納米銀復合材料切成30mm×5mm條狀，置于去熱原的25ml錐形瓶中，按受試材料3cm²：1ml氯化鈉注射液的比例，取一定量的氯化鈉注射液于錐形瓶中，置于37℃電熱恒溫培養箱中浸提72h。72h后將浸提液轉移至另一去熱原的錐形瓶中，調節pH值為7.0左右，4℃保存備用。以上過程均在潔凈工作臺上按無菌操作要求進行。

1.3.3.2 熱原檢查法：根據GB/T16175-1996熱原試驗，在試驗前7天選3只家兔，雌雄不限，雌兔無孕，且測溫前7天內應在同一環境條件用同一飼料飼養，在此期間家兔體重無減輕，精神、食欲、排泄等無異常。預測體溫時用肛溫計插入家兔肛門，深度約6cm，時間為2min，取出肛溫計并記下讀數。每隔lh測量1次，共測4次，體溫均在38.O～39.6℃的范圍內，且最高最低體溫的差數不超過0.4℃，符合熱原試驗要求。

3天后將家兔固定于固定器內。30min后開始第1次測量，以后每隔30min測1次，共測2次。體溫之差不超過0.2℃，以此2次體溫的平均值為該兔的正常體溫。且當日使用家兔的體溫在38.0～39.6℃的范圍內，各兔間正常體溫之差不超過1℃。在家兔正常體溫符合要求后15min內，自耳靜脈緩慢注入預熱38℃丹參納米銀復合材料浸提液，劑量為l0ml/kg。注射后每隔1h測量體溫1次，6次體溫中最高的1次減去正常體溫為試驗家兔體溫升高值。

1.3.4 原發性皮膚刺激試驗：受試家兔6只，實驗前24h，脊柱兩側各選2個3cm×3cm面積的去毛區，用8％的硫化鈉溶液去毛，間距l0cm。用75％(v/V)乙醇消毒背部去毛區，用2.5cm×2.5cm濾紙塊浸泡于丹參納米銀復合材料的浸提液中至飽和，貼敷于試驗部位。浸提介質生理鹽水作為陰性對照，3.5％甲醛溶液作為陽性對照。材料貼敷于皮膚后，立即用3cm×3cm紗布塊覆蓋，最外層用膠布固定。貼敷固定24h后，移去貼敷物，用溫水清潔貼敷區l并吸干，觀察移去斑貼物后24、48和72h皮膚的紅斑及水腫情況。計算原發刺激指數(PII)，參考文獻標準進行記分并評價。

1.3.5 皮內刺激試驗：實驗前24h，受試家兔脊柱兩側各剪剃5cm×25cm區域兔毛，應避免損傷皮膚。用75％(V/V)乙醇消毒暴露的皮膚。在兔脊柱兩側各選擇10個點，每點間隔2cm，每點皮內注射劑量0.2ml。一側前5點注射丹參納米銀復合材料生理鹽水浸提液，后5點注射同批陰性對照生理鹽水；另一側前后5點分別注射丹參納米銀復合材料植物油浸提液和陰性對照植物油。注射后24、48、72h觀察注射局部及周圍皮膚組織反應，參考文獻標準進行記分并評價。

1.3.6 急性全身毒性試驗：將健康小白鼠隨機分為試驗材料組和對照兩組，每組5只。試驗組動物由尾靜脈注射丹參納米銀復合材料生理鹽水浸提液，劑量為50ml/kg。對照組動物由尾靜脈注射同批號的生理鹽水，劑量為50ml/kg。注射后于24、48、72h觀察記錄試驗和對照組動物的一般狀態、毒性表現和死亡動物數。觀察指標參考文獻標準。

1.3.7 銀含量測定；0.2kg左右健康成年SD大鼠48只，隨機分為正常對照組(12只)，治療I組(創面外敷丹參納米銀復合材料，12只)、治療II組(創面外敷納米銀仿生敷料，12只)、治療III組(創面外敷磺胺嘧啶銀粉劑，12只)。治療I組、II組、III組sD大鼠用取皮刀造成10％～13％TBSA(Tota]Body Surface Area)深II度切割傷。

治療I組、治療II組和治療III組在治療前和治療后2天、4天、5天、7天、13天和16天眼眶采血，采用火焰原子吸收分光光度法測定sD大鼠血液中銀的含量。當創面恢復半個月后處死SD大鼠，取其肝、腦、腎，用火焰原子吸收分光光度法測定各組織中的銀含量。

1.3.8 統計學處理：銀含量檢測數據，用State 7.0統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 無菌試驗結果：培養5天后，接種有丹參納米銀復合材料的需氧一厭氧菌培養管、環境監測的陰性對照管無菌生長，陽性對照管有菌生長；培養7天后，接種有丹參納米銀復合材料的真菌培養管、環境監測的陰性對照管無菌生長，陽性對照管有菌生長，說明該材料無菌。

2.2 熱原試驗結果：由表l可見，3只家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.4℃，說明該材料無熱原。

2.3 原發性皮膚刺激試驗結果：由表2可見，丹參納米銀復合材料浸提液貼敷家兔皮膚未見紅斑，無水腫形成，說明該材料對家兔皮膚無刺激性。

2.4 皮內刺激試驗結果：表3為皮內刺激試驗的結果，可見丹參納米銀復合材料無皮內刺激反應。

2.5 急性全身毒性試驗結果：急性全身毒性試驗結果見表4。

2.6 全血中銀含量的變化：從表5中可以看到丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組各個時點血銀的含量明顯比磺胺嘧啶銀組低，丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組全血銀含量無差異(P＞O.05)。丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組銀含量最高是正常水平的7倍，而磺胺嘧啶銀組高達26倍。第13天，丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組SD大鼠血銀含量基本恢復正常水平(與正常組銀含量0.07±0.03/zg/g相比，P＞0.05)，而此時磺胺嘧啶銀組SD大鼠銀含量是正常全血銀的5倍(P＜0.01)。

2.7 各組織中的銀含量：正常sD大鼠肝、腦、腎及血中銀含量無統計學意義(p＞0.05)。對深II度切割傷大鼠使用丹參納米銀復合材料、納米銀仿生敷料和磺胺嘧啶銀后，各組織銀含量都有不同程度的升高，其中肝銀含量升高最多，其次為腎，說明肝臟對銀的吸收最多，因此如過量吸收會首先造成對肝臟的損害。另外，磺胺嘧啶銀組中各組織的銀含量明顯高于丹參納米銀組、納米銀仿生敷料組，其中磺胺嘧啶組肝臟中銀含量是正常的近100倍(P＜0.01)，有統計學意義。

3 討論

納米產品在醫學生物學領域已經得到廣泛的應用，應用前景十分廣闊。本文對自制的丹參納米銀仿生敖料進行了初步的安全性評價，主要有無菌、熱原及銀在體內的分布、蓄積情。試驗證實丹參納米銀復合材料無菌、無熱原、無皮膚刺激、無皮內刺激作用。同時因銀如過量吸收會造成機體的損害，我們用火焰原子吸收分光光度法對SD大鼠血液及肝、腦、腎等各器官的銀含量進行測定，發現用該復合材料的治療組大鼠比磺胺嘧啶銀組大鼠對銀的吸收少。其原因為：銀發揮生物活性，必須以溶液形式存在，如：Ag⁺或Ag⁺Ag⁺通常存在于硝酸銀、磺胺嘧啶銀和其它銀離子化合物中。Ag^°是存在于金屬或晶體(包括納米晶體)中，不帶電荷的存在形式。在溶液中，它以亞晶體形式存在，小于8個原子的大小。硝酸銀、磺胺嘧啶銀在濃度大于3200ppm時釋放銀離子，但是大部分都因形成化學復合物而快速失活。而納米銀提供Ag^°形式的銀，與離子形式相比較，這種形式的銀大部分不與鹵化物結合，在有機物質中滅活的速度大大降低，有效的銀相對更多。因此，在達到同樣的治療效果時，機體對納米銀的吸收更少，減小了銀中毒的可能性，提高了使用的安全性。

編輯 張惠娟

基金項目：江蘇省科學技術廳社會發展項目(BS2005030)，江蘇省人事廳“六大人才高峰”資助項目，江蘇省“青藍工程”學術帶頭人項目，江蘇省教育廳高新技術項目(JH03－041)及自然科學項目(03KJBl50107，s30016)

通訊作者l：潘立群，教授，主任醫師，博士研究生導師：E－mail：dexuansir@hotmail.com

通訊作者2：顧海鷹，教授，博士研究生導師；E－mail：hyguOntu.edu.cn：guhy99@21cn.com