改良豬耳郭軟骨細胞體外培養的實驗研究

[摘要]目的：為組織工程化軟骨修復機體軟骨缺損提供實驗基礎。方法：用消化組織塊培養法體外培養豬耳郭軟骨細胞，并觀察其在Polyglycol icacid(簡稱PGA)支架上的生長情況。結果：軟骨細胞在pH值為7.0，含10％胎牛血清的DMEM培養液中生長良好，可傳代1O代，細胞數目擴增為原來的400～500倍；軟骨細胞在PGA支架上生長良好，分泌基質旺盛。結論：改良消化組織塊方法培養軟骨細胞是一種可以大量擴增軟骨細胞數目的確實可行的方法，PGA是軟骨細胞良好的生長支架。

[關鍵詞]組織工程；軟骨細胞；體外培養

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)05－0607－02

1 材料和方法

1.1 實驗用品

1.1.1 實驗器材：直徑10cm的一次性塑料培養皿(德國生產)若干個，50ml一次性塑料離心管數支(美國生產)，細胞培養器材一套。

1.1.2 實驗試劑：0.2％II型膠原酶(美國Sigma公司)、DMEM細胞培養基(杭州上城科創中心)、胎牛血清、0.25％的胰蛋白酶(美國Sigma公司)、PBS液、青霉素、鏈霉素、VitC、谷氨酰胺。

1.2 細胞培養液的制備：在DMEM加入Vitc 50mg、谷氨酰胺300mg，按1OOU/ml、100ug/ml分別加入青、鏈霉素，用前加入無菌胎牛血清，使其最終濃度為10％。調pH值為7.0左右，過濾消毒。

1.3 軟骨組織的取材：小豬浸泡在75％酒精溶液中半小時后，在無菌操作下切下豬耳郭，仔細剝去皮膚和骨膜，用眼科剪將軟骨組織剪成3mm左右的小方塊，置于離心管中，加氯霉素沖洗液沖洗3次，再用PBS液沖洗3次。

1.4 軟骨細胞的提取

1.4.1 消化：在上述盛軟骨碎塊的離心管中加入0.2％II型膠原酶，體積約為軟骨體積的2倍，置于37℃的恒溫振蕩床中振蕩、消化。

1.4.2 收集細胞：3～4h后第一次收集軟骨細胞。將上述懸濁液倒入150目不銹鋼濾篩濾去軟骨組織，用于隔夜消化，第二天早上收集。過濾的液體2000r/min離心8min，輕輕吸除消化液，加入PBS液，漂洗1次，加入細胞培養液16ml，振蕩混和制成細胞懸液。

1.4.3 計數、檢查細胞活力

1.5 細胞培養方法

1.5.1 接種：每個培養皿加入8ml培養液(含10％的胎牛血清)，加入細胞懸液，每個培養皿接種2×10⁶個細胞，輕微搖動培養皿，使細胞均勻的分布于培養皿中，置入37℃5％CO₂溫箱培養。

1.5.2 換液：培養第3天細胞已開始分裂生長，此時應更換培養液。具體方法是：用吸管吸去培養液后再加入等量新的培養液，置溫箱繼續培養。

1.5.3 傳代：吸干培養液，用PBS液輕洗細胞1次，培養皿內加入0.25％的胰蛋白酶，以覆滿皿底為限，置溫箱2min后，顯微鏡下觀察到細胞質已回縮，細胞間隙增大，即向培養皿里滴入2ml左右含血清的培養液終止消化，用套有軟管的吸管輕輕刮下皿底細胞，使細胞徹底從培養皿底壁脫落，用吸管吸取混和液，制成細胞懸液，計數，觀察細胞活力，按每個培養皿接種2×10⁶個細胞，置入37℃ 5％CO₂溫箱培養。

1.5.4 將培養的l×10⁸個軟骨細胞接種在制備好的PGA支架上，置入37℃5％CO₂溫箱培養，觀察軟骨細胞的生長情況。

2 結果

2.1 軟骨細胞生長情況：倒置顯微鏡下觀察，剛分離出的軟骨細胞呈圓形，有較強折光性，貼壁時間平均為10h，延伸時間為24h，4天左右形成單層細胞，細胞排列緊密，呈多角形。第一代傳代后，軟骨細胞貼壁時間平均為3h，延伸時間7h。第4天細胞已接近長滿培養皿，此時進行傳代。第二代傳代細胞生長速度較快。隨著代數的增加，細胞牛長速度越來越慢，細胞傳代間隔的時間越來越長，連續培養至第10～11代，見細胞形態向成纖維細胞型轉化，呈梭形，細胞間隙變大，輪廓增強，胞漿內可見空泡、脂滴，增殖速度減慢，表明細胞已開始老化變性。此時收集到的細胞約為原來400～500倍。

2.2 軟骨細胞接種在PGA支架上，可見呈膜片狀，軟骨細胞分泌基質旺盛，軟骨細胞與基質粘附良好，中央不透明為大量細胞層疊，與支架粘附生長。

3 討論

軟骨組織結構致密，較難消化，消化酶的pH值、濃度及消化時間，對收集到的細胞的量及活力影響較大。另外，軟骨細胞在培養、傳代、擴增過程中對血清、培養皿以及傳代的時機要求較為嚴格。

3.1 消化酶pH值、濃度及消化時間的確定消化酶的pH值制約著其活性，消化酶的濃度決定著組織消化時間的長短，過長會降低細胞的生命活力，甚至使細胞死亡，消化時間過短，又收集不到細胞。作者采用0.2％pH值為7.0的II型膠原酶，在37℃恒溫振蕩下，消化軟骨組織，4h后第一次收集收集細胞，測得細胞活力為85％。過濾的軟骨組織用消化過的II型膠原酶繼續消化，隔夜第二次收集。這樣比過去用0.15％II型膠原酶隔夜消化收集到質量好數目多的細胞。

3.2 血清的選擇：血清中含有細胞增殖所需的生長因子和活性物質，培養液中血清的質量在很大程度上影響著細胞的生長。筆者采用了DMEM培養液后，細胞傳代時間明顯縮短，只需要4天，而以往采用F12培養液，則需要6天，說明DMEM培養液更適合軟骨細胞的生長。

3.3 細胞傳代時消化時機的把握：①消化酶的濃度、pH值及消化時間對細胞傳代極為重要，濃度高則細胞反應快，掌握不好，細胞易死亡，濃度低和pH值不當時細胞消化慢，消化下來的細胞成片，不利計數。本實驗采用pH值為7.0、濃度為0.25％的胰蛋白酶，在37℃溫箱里消化2min，取得滿意效果。②把握好傳代時機，在80％～90％匯合階段最合適，過早傳代細胞產量少，過晚細胞密度太大而出現接觸抑制和細胞毒性作用，細胞的健康狀態不佳。

3.4 軟骨細胞在體外培養中的特性：軟骨細胞在體外經培養一段時間后，細胞易老化，喪失分泌基質的能力，從而難以從少量的軟骨組織培養中獲得大量的軟骨細胞。筆者在實驗中對傳代方法的改進，不需要離心，有利于保護細胞，收到了很好的效果。軟骨細胞可傳到11代。

3.5 PGA是軟骨細胞良好的粘附生長的支架，有利于軟骨細胞分泌基質。而如何促進軟骨細胞的生長，減慢軟骨細胞衰老的速度，仍是組織工程化修復軟骨缺損亟待解決的問題。

編輯 張惠娟

基金項目：汕頭市科技局基金資助(編號：2004102)