角質形成細胞源ＩＬ－１α對成纖維細胞增殖及膠原分泌的影響

[摘要]目的：研究角質形成細胞分泌的IL-1α對成纖維細胞生物學行為的影響。方法：組織塊法培養成纖維細胞，消化法培養角質形成細胞，采用免疫組化方法檢測角質形成細胞分泌的IL-1α；成纖維細胞中加入含不同濃度IL-1α抗體(0．04μg／ml，0．2μg／ml，1μg／ml)的角質形成細胞條件培養液為實驗組，含DMEM的條件培養液為對照組，采用Cell counting kit-8、放免法測定成纖維細胞增殖、膠原合成。結果：細胞爬片可見大量染色陽性角質形成細胞，細胞增殖測定，各實驗組吸光度(A)值與對照組比較，差異均有統計學意義(ρ＜0．01)；隨抗體濃度增高，A值減小，0．2μg／ml及1μg／ml濃度組與0．04μg／ml濃度組比較，差異有統計學意義(ρ＜0．01)；膠原分泌濃度測定，各實驗組與對照組比較，差異均有統計學意義(ρ＜0．01)；隨抗體濃度及膠原濃度增高，0．2μg／ml及1μg／ml濃度組與0．04μg／ml濃度組比較，差異有統計學意義(ρ＜0．01)。結論：正常角質形成細胞分泌大量IL-1α，可促進成纖維細胞增殖，抑制膠原分泌。

[關鍵詞]角質形成細胞；IL-1α；成纖維細胞；細胞增殖；膠原分泌

[中圖分類號]R329．2⁺8 [文獻標識碼]A[文章編號]1008—6455(2006)12-1337-02

基金項目：國家自然科學基金資助(編號：30371469)

通訊作者：郭樹忠，教授，主任醫師，博士研究生導師，科主任；

E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn

角質形成細胞能夠促進成纖維細胞增殖并抑制其膠原合成，這種作用是由角質形成細胞分泌的各種活性因子來實現的。但角質形成細胞分泌的每一種因子對成纖維細胞到底有什么具體作用，現在研究的還不是很清楚。IL-1α是角質形成細胞分泌的重要因子，可調節成纖維細胞大量基因的表達，影響多種生物活性因子合成與分泌，也是角質形成細胞-成纖維細胞相互作用環路中的一個主要因子。但其對成纖維細胞的具體作用仍不明確，故我們對其進行了研究。

1 資料和方法

1．1材料：無血清角質形成細胞培養基(Keratinocyte-SFM，KSFM，Gibco公司，美國)，DispaseⅡ酶(Gibco公司，美國)，DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco公司，美國)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，人Ⅲ型前膠原(PCⅢ)放免試劑盒(海研所)，Cell countingkit-8(CCK-8，Dojindo，日本)，IL-1α抗體(RD公司，美國)，生物素化兔抗山羊IgG和ABC復合物(Vector公司，美國)。

1．2細胞培養

1．2．1角質形成細胞培養：選用正常小兒包皮組織(來自包皮環切術)，按常規角質形成細胞培養方法培養正常的角質形成細胞。細胞融合達80％～90％時換為無生長因子的角質形成細胞專用培養基，48h后收集上清，-70℃保存備用。用前以DMEM稀釋配制成50％的濃度。

1．2．2皮膚成纖維細胞培養：用組織塊法進行原代培養，常規消化、傳代，實驗選用第2～10代細胞。新生牛血清濃度為10％。

1．3方法

1．3．1角質形成細胞源IL-1α測定：采用免疫組化方法。將蓋玻片置于6孔板中，加入角質形成細胞(二代)。當細胞爬片融合近80％時取出，0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffed saline，PBS)浸洗5min×3次，4％多聚甲醛固定15min；再次PBS浸洗5rain×3次，山羊抗IL-1抗體(1u／ml)孵育切片，室溫下24h，后用PBS再浸洗5min×3次；生物素化的兔抗山羊IgG(1：400)孵育切片，室溫下4h，PBS浸洗5min×3次；生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復合物(ABC復合物，1：500)孵育切片，室溫2h。蘇木精染液行細胞核襯染，中性樹膠封片，光鏡下觀察。陰性對照：一抗用牛血清白蛋白稀釋液替代。

1．3．2 IL-1α對成纖維細胞增殖作用測定：采用CCK-8試劑盒。取對數生長期的成纖維細胞。胰酶消化，含10％小牛血清的DMEM調整細胞濃度為5×10⁴／ml，每孔200μl接種于96孔中，過夜后棄去上清，每孔加入DMEM培養24h，細胞處于70％～80％融合狀態，棄上清，再加入不同濃度條件培養液(conditioned media，CM)180μl(90μl50％濃度上清液+90μl含不同濃度抗體PBS)，共5組，每組重復6孔，繼續培養24h后加入CCK-8 10μl，2～3h后在450nm處測吸光度A值。

1．3．3細胞上清液中PCⅢ含量的測定：采用放免試劑盒，取對數生長期細胞，調節細胞濃度為1×10⁵／ml，接種于48孔板中，每孔200μl，過夜后棄去上清換為不同濃度的條件培養液，繼續培養1天，取上清液100μl，用放免法測定上清液中PCⅢ的含量。

1．3．4統計學處理：采用SPSS10．0統計軟件進行統計學處理，數據以互x±s表示。細胞增殖及膠原分泌數據采用兩兩比較Snq-t檢驗。

2 結果

2．1在免疫組化片中，陽性組可見大量胞漿被染成棕黃色的角質形成細胞，以牛血清白蛋白稀釋液作為對照的未見明顯胞漿陽性細胞(圖1、2，見中插2)。

2．2角質形成細胞源IL-1α對成纖維細胞增殖的影響：IL-1α對成纖維細胞增殖有明顯的促進作用，以IL-1α抗體阻斷后，CM促增殖作用減弱；隨IL-1α抗體濃度增高，CM促增殖作用漸減弱，在0．2μg／ml時達高峰¹ρ＜0．01，²ρ＜0．01)，表1。

2．3角質形成細胞源IL-1α對成纖維細胞分泌Ⅲ前膠原的影響

IL-1α抑制成纖維細胞膠原分泌，以IL-1α抗體阻斷后，CM促膠原分泌增強；隨IL-1α抗體濃度增高，分泌膠原濃度增高，在0．2μg／ml時達高峰(³ρ＜0．01，⁴ρ＜0．01)，表1。

3 討論

在炎癥期，IL-1α主要是由巨噬細胞分泌，而在傷口愈合后期，主要由角質形成細胞及成纖維細胞分泌，在我們的免疫組化片中，可見到大量染色陽性的細胞，可見在增殖狀態的角質形成細胞中，確實合成并分泌大量的IL-1α。

IL-1α是角質形成細胞一成纖維細胞相互作用環路中的重要中介物質，角質形成細胞分泌IL-1α，引起成纖維細胞分泌大量的KGF、IL-6，再反作用于角質形成細胞，促進其增殖。在本實驗中，發現IL-1α對成纖維細胞的增殖有明顯的促進作用，在以中和抗體阻斷其作用后，成纖維細胞的增殖明顯受到抑制，而這種作用在0．20μg／ml濃度時達到最強，這與我們以前實驗結果相吻合。這可能是由于：①IL-1α作為一個炎性因子，確實可促進成纖維細胞增殖；②IL-1α引起其他生長因子的釋放，從而促進成纖維細胞增殖。角質形成細胞與成纖維細胞共同培養時，可引起成纖維細胞343條基因發生變化，其中，69條基因編碼一系列生長因子、化學因子、細胞因子及他們的受體。基因表達調高的主要因子有EGF、FGF、VEGF、IL-8、PAL-1、IGFBP-3、PGE等，而大部分因子的變化全部由角質形成細胞源IL-1α介導，其余的由IL-1α部分介導。故IL-1α可通過使這些因子的高表達促進成纖維細胞增殖而促進創面愈合。

在膠原合成與分泌方面，IL-1α一直被認為是一個促進膠原降解的因子。以IL-1α抗體阻斷其作用后，發現雖然總的成纖維細胞數量減少了，但在上清液中測到的三型前膠原量卻增加了。目前，學者認為這主要是由于IL-1α可引起成纖維細胞分泌大量的MMP-1、MMP-3，促進了膠原的降解；同時IL-1α抑制成纖維細胞分泌CTGF，而CTGF是一強有力的促進基質細胞合成膠原的因子。IL-1α的合成減少，正是增生性瘢痕的形成原因之一。Niessen FB測定12個月后仍然呈增生狀態的瘢痕發現其表皮層中所含的IL-1α量明顯低于正常瘢痕及已漸萎縮的增生性瘢痕，而在3個月時，在基底層及血管周圍IL-1α高表達的增生性瘢痕在12個月后趨于正常的可能性明顯增高。

由此，我們設想在對一些難愈創面或者愈合后瘢痕增生發生幾率極高的創面進行治療時，在早期即投入大量外源性IL—1α，彌補角質形成細胞的分泌不足，或者對這些分泌不足的角質形成細胞進行基因修飾，使其能大量分泌IL-1α，應該能達到促進創傷愈合，減少瘢痕的作用。

雖然角質形成細胞分泌的IL-1α介導成纖維細胞一角質形成細胞相互作用，其分泌的多少對創面愈合及增生性瘢痕的產生有密切關系，但創面愈合、瘢痕增生是大量因子的綜合作用結果，故我們需要繼續對IL-1α及其他重要因子間的協同作用進行進一步研究。

[收稿日期]2006-09-14 [修回日期]2006-12-15

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。