ＩＧＦ－１Ｒ抗體對兔耳瘢痕組織的影響

作者：陶蕓，趙亞南，王繼華，張景波，肖鴻，劉紅莉

[摘要]目的：觀察胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)抗體對兔耳增生性瘢痕組織的影響。 方法：建立兔耳增生性瘢痕動物模型，21天后瘢痕局部注射不同濃度的IGF-1R抗體或生理鹽水，連續7天，觀察1個月。分別對瘢痕增生指數(hypertrophicindex，HI)、成纖維細胞數和膠原含量的變化進行比較。結果：一定劑量IGF-1R抗體組HI值、成纖維細胞數量以及膠原含量比對照組減少(ρ＜0．01或0．05)。 結論：IGF-1R抗體能抑制兔耳瘢痕組織增生。

[關鍵詞]胰島素樣生長因子-1受體；增生性瘢痕；動物模型

[中圖分類號]R619+．6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2006)12—1334—03

[基金項目]云南省教育廳科學研究基金項目(04J876C)

通訊作者：趙亞南，男，教授，主任醫師，碩士研究生導師。

E-mail：yzha04@hotmail．com

傷口愈合后期成纖維細胞增殖及合成、分泌旺盛，引起細胞外基質過度沉積導致增生性瘢痕的形成。生長因子持續刺激是創傷愈合后瘢痕增生的原因之一，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)能促進細胞分化，又與成纖維細胞增殖、活躍程度密切相關，是影響創面愈合的重要因子之一。近年來研究發現，增生性瘢痕中大量表達IGF-1及其受體，并認為可能與瘢痕的形成密切相關。本研究即利用外傷性兔耳早期瘢痕增生模型，觀察并研究IGF-1R抗體對增生性瘢痕組織的影響，初步探討IGF-1及其受體與瘢痕增生的關系。

1 材料和方法

1．1試劑及儀器：IGF-IR抗體購自深圳晶美生物制品有限公司。XSB211型OLYMPUS光學顯微鏡、TD-2000真彩色病理顯微圖像分析系統和LEICA RM2145超薄切片機由昆明醫學院重點實驗室提供；LEICA DM 6000B病理圖像分析儀由云南藥物研究所提供。

1．2實驗動物：健康日本大耳白兔20只，雌雄各半，體重

2．2～2．6kg，購自昆明醫學院動物實驗中心。

1．3實驗方法

1．3．1動物模型的建立：兔適應性喂養72h，用3％戊巴比妥鈉(1ml／kg)耳緣靜脈注射麻醉。在兔雙耳腹側部分沿長軸避開可見血管，分別做6個直徑1．0cm的圓形切口，切口間隔1．0cm，完整切除全層皮膚，去除軟骨膜，用熱金屬絲點灼創緣皮膚，至輕微結痂，達到充分止血，術畢創面用無菌紗布包扎固定。每只兔12個創面，共240個創面。術后一周去痂，自然愈合。術后21天左右，約有90％的創面形成外觀凸起的瘢痕組織，隨機取樣，病理證實為外傷性早期兔耳瘢痕增生。

1．3．2動物組別和處理：兔耳瘢痕模型制作成功后，隨機將每只兔耳的8個瘢痕塊分為4組：生理鹽水溶劑對照組(A組)、IGF-1R Ab 1．5μg／ml劑量組(B組)、3．0μg／ml劑量組(C組)和6．0μg／ml劑量組(D組)，共20只兔，故A～D組各有瘢痕塊40個。術后第21天，分別對各組瘢痕基底部及瘢痕灶內注射不同濃度的IGF-1R抗體或生理鹽水，每日注射1次，持續7天，每次注射用量為20μl。

1．3．3標本取材及處理：用藥后第3、7、11、20、30天，在同樣的麻醉條件下切取瘢痕組織及周圍正常組織標本于10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋切片，行蘇木素一伊紅染色(HE)和膠原染色(VG)。光鏡下觀察HE染色切片，用測微尺測出瘢痕最高點至耳軟骨表面的垂直厚度(a)、瘢痕周邊正常皮膚至耳軟骨表面的垂直厚度(b)，測算出瘢痕增生指數(hypertrophic index，HI=a／b)。每張組織切片分別隨機選5個不重疊視野(×200)，HE染色切片鏡下目測計數成纖維細胞數、VG染色切片定量檢測膠原面密度的變化。

1．3．4統計學處理：實驗結果用x±s表示，采用SPSS11．5軟件包做統計學分析。

2 結果

2．1形態學觀察：兔耳腹側形成創面后，傷口約13～16天愈合，上皮化時即能觸到硬塊，此硬塊不斷高于皮膚，21～23天時增生達到高峰，厚度約為兔耳腹面正常皮膚厚度的2-3倍，質硬，色紅。實驗末期生理鹽水對照組瘢痕仍維持較明顯的增生狀態，充血明顯呈紫紅色，質硬；B～D組瘢痕均出現萎縮，表現為瘢痕體積減小，充血減輕，變平變軟、色澤變淺，其中C、D組最為明顯。

2．2組織學觀察

2．2．1 HE染色切片：與正常的兔耳全層結構相比，生理鹽水對照組和B-D組瘢痕組織均厚于正常組織，尤其生理鹽水對照組，可厚達正常組織的3倍，表皮呈波浪狀明顯增厚。實驗組軟骨有明顯的增生，炎性細胞較多，成纖維細胞核大、增生旺盛，毛細血管增生明顯，膠原纖維粗大，排列紊亂。瘢痕淺部可見環形或漩渦狀分布，深部則平行排列于軟骨，軟骨增生明顯。B～D組瘢塊內成纖維細胞減少、核變細小，胞質減少，瘢痕厚度較薄，可見少量毛細血管；以C、D組明顯(圖1、2，見中插1)。

2．2．2 VG染色切片：對照組膠原纖維呈紅色，細胞顏色淺灰，散在分布于膠原纖維問。與對照組比較，C、D組的膠原纖維染色較淡，較為疏松，纖維排列較為規整(圖3，見中插1)。

2．3瘢痕增生指數：各組在不同時相點的HI值結果見表1，B～D組HI值隨時間延長逐漸降低而A組則逐漸升高，C、D兩組各時間點均比生理鹽水對照組降低(ρ＜0．01或0．05)。

2．4成纖維細胞計數和膠原面密度測量值：見表2、3。結果顯示：與A組比較，C、D組成纖維細胞和膠原面密度減少非常明顯(ρ＜0．01)，B組與A組比較差異無統計學意義。

3 討論

增生性瘢痕是整形外科基礎研究的重要課題之一，研究發現多種細胞因子在瘢痕形成中起作用，其中IGF-1及其IGF-1R介導的信號通路對瘢痕形成可能起著十分重要的作用，能夠誘導體外培養的成纖維細胞合成和分泌膠原等胞外基質，影響創面愈合后組織的改建。體外實驗表明，生理濃度的IGF-1即可有效抑制成纖維細胞的凋亡，維持細胞的生存；IGF-1R激活后還可上調許多細胞因子如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等表達，促進細胞增殖和創面愈合后瘢痕的形成。Ghahary等研究發現，IGF-1能降低燒傷后增生性瘢痕中成纖維細胞合成膠原酶mRNA的水平和膠原酶的活性。Ishihara檢測到增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纖維細胞大量表達IGF-1受體，并且認為由此抑制了細胞凋亡的發生或打破了細胞增殖和凋亡的平衡，進而使得細胞外基質大量表達和沉積。

嚴重炎癥或傷口愈合延遲等原因將會導致增生性瘢痕的形成，增生性瘢痕以排列不規整、漩渦狀或團塊狀的膠原大量沉積和旺盛增生的成纖維細胞為特征。雖然對這種改變的生物機制尚不清楚，但已發現病變部位膠原合成明顯高于正常皮膚，而成纖維細胞則是膠原生成的主要來源。因此，能調控成纖維細胞的增生或增殖，將會明顯減輕瘢痕的增生，改善創面的修復。近年來有關IGF-1及IGF-1R的研究認為，IGF-1具有促進成纖維細胞分泌、產生纖維性蛋白的作用，并能促進皮膚的成纖維細胞產生纖維粘連蛋白、1型前膠原的前a1(Ⅰ)鏈和Ⅲ型前膠原的前al(Ⅲ)鏈的mRNA表達增加。IGF-1的功能主要靠與IGF-1受體結合來介導完成，別的生長因子如血小板生長因子(PDGF)和表皮生長因子(EGF)及其受體可誘導產生IGF-1又能增加IGF-1連接位點的數量，還采用IGF-1自泌途徑來刺激細胞增殖，甚至PDGF、EGF受體的促分裂作用和轉化潛能也可能與IGF-1R有關。靶向破壞EGF受體或PDGF受體時，可使細胞在一定程度上得到抑制，但有些細胞通過表達IGF-1R，這種抑制作用可得到阻止，生長作用得以恢復。阻斷IGF-1R，便能下調其他生長因子受體的表達，因此，通過靶向破壞IGF-1受體或受體基因比破壞其它生長因子或受體基因對細胞的生長抑制作用更徹底。

從對兔耳增生性瘢痕的研究看，局部注射一定濃度外源性的IGF-1R的抗體能有效減輕瘢痕增生的程度，使其變軟變平，顏色變淺，瘢痕增生指數也明顯降低。另外，通過HE和VG染色觀察到，與對照組A組比較，注射后第三天B、C和D組的成纖維細胞計數和膠原纖維面密度開始降低，并且持續到第30天，但只有C和D組的降低與對照組比較有顯著性差異。說明兔耳瘢痕生長過程中，IGF-1R抗體可能阻斷了IGF-1與IGF-1R的結合，直接抑制成纖維細胞的生長增殖，從而減少膠原的合成、分泌；另外，可能通過膠原酶的增加、膠原酶活性的增強，促使已形成的膠原纖維降解、重吸收，減輕瘢痕組織的增生。

本實驗中能較長時間抑制瘢痕的增生，除了IGF-1及其受體的作用受影響外，還可能阻止了別的生長因子如EGF、FGF及其受體與IGF-1R的協同作用的發揮，進一步抑制了IGF-1的促成纖維細胞增殖和促瘢痕增生的作用，改變了增生性瘢痕持續增生的狀態。

應用兔耳增生性瘢痕模型，觀察阻斷IGF-1與其受體的結合對增生性瘢痕的抑制作用，較體外培養的增生性瘢痕成纖維細胞進行的相關實驗真實可靠，為人類增生性瘢痕機制的研究提供了理論和實驗依據。但IGF-1及IGF-1R或與其他生長因子及受體對瘢痕增生影響的具體機制還有待進一步的研究。

[收稿日期]2006-09-11 [修回日期]2006-12-08

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。