人表皮生長因子與堿性成纖維細胞生長因子納米緩釋劑對成纖維細胞的影響

作者：隋繼強，韓巖，吳紅，鄭巖，易成剛，郭樹忠

[摘]目的：制備堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(EGF)可降解緩釋微球，考察其生物活性的保存情況，以及它們對成纖維細胞的作用。方法：采用改良的乳化冷凝法交聯制備復合bFGF、EGF的明膠緩釋微球，將它們加入成纖維細胞的培養液中，用細胞計數法、四甲基偶氮唑鹽微量反應比色法(MTT法)測定細胞增殖情況。結果：復合bFGF、EGF的緩釋微球平均粒徑(11．32±3．64)μm；培養1天后各組細胞計數、吸光度(A)值差異均無顯著性；5天后，兩種生長因子緩釋微球組細胞計數、吸光度(A)值明顯高于對照組；7天后，兩種生長因子緩釋微球組值仍高于其它組，但差異無顯著性。結論：復合bFGF、EGF的緩釋微球制備工藝簡便，成球性好；能較長時間地持續釋放活性bFGF、EGF，可促進成纖維細胞的增殖。

[關鍵詞]成纖維細胞生長因子；人表皮生長因子；微球體；明膠；成纖維細胞；緩釋制劑

[中圖分類號]R813 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(206)12-1342-04

基金項目：陜西省自然基金(編號：434512201)

通訊作者：郭樹忠，教授，博士研究生導師，主任醫師；

E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn

人表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的應用研究一直是創面治療領域最活躍的課題之一。但是，bFGF在體內的半衰期僅為3-10min，全身或局部應用的效果不能滿足臨床應用需要。表皮生長因子的變異性蛋白質二級空間結構限制了其內在的生物功能特性，而且局部使用的表皮生長因子類制劑在接觸皮膚創面的數分鐘內就可被創面滲出液中的蛋白酶降解破壞，被降解的小分子肽又可在創面引起明顯的局部炎性反應，所以在臨床應用中難以發揮促進上皮增殖的作用。因此，有學者開始研究bFGF微球等緩釋制劑的類似作用。經檢索文獻，目前國內只有bFGF緩釋制劑、EGF緩釋制劑及其相關實驗研究的報道，而未見到bFGF、EGF兩種生長因子緩釋制劑合用對創面治療相關實驗研究的報道。bFGF、EGF制備成納米緩釋劑后，其生物活性的保存情況是衡量微球質量的一項重要指標。因此，我們將bFGF、EGF兩種生長因子緩釋制劑加入成纖維細胞培養液中，采用細胞計數法、細胞活力檢測法和細胞周期分析法，考察納米緩釋劑中bFGF、EGF兩種生長因子生物活性的保存情況，并觀察緩釋bFGF、EGF對成纖維細胞的作用。

1 材料和方法

1．1試劑與設備：bFGF凍干粉劑、EGF(珠海億勝生物制劑有限公司)、DMEM復合培養液(美國Gileco公司)、明膠(等電點50，相對分了量99000，美國Sigma公司)、Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)、噻唑藍(美國Sigma公司)、美國Bio-RAD Model 550酶標分析儀、美國Elite SP型流式細胞儀、日本H600．1V型透射電鏡、美國FJ-2003型計數儀。自制bFGF-明膠微球、EGF-明膠微球。人bFGF定量ELLSA試劑盒(QuantiKineR，RDsystems)，250g／L戊二醛、丙酮、異丙醇、無水乙醚、液體石蠟、氨基乙酸為國產分析純，Span-80(美國Sigma公司)為進口分析純，水為雙嘆蒸水，JJ21型精確電子攪拌儀，TGL216G高速離心機，GENESIS凍干機(Virtis公司)，BX241數碼顯微鏡(Olympus)。

1．2方法

1．2．1 bFGF-明膠微球的制備：將含有10g／L Span-80的液體石蠟30ml置于三口瓶中預熱至55℃，快速攪拌下滴加入同樣溫度的明膠水溶液4ml，并調節攪拌速度至450r／min，繼續攪拌10min；形成油包水乳劑后迅速改冰浴，繼續攪拌10min，使其完全固化：加入250g／L戊二醛0．1ml，攪拌下預固化2h，4℃固化24h，用適量丙酮、異丙醇、乙醚洗滌，揮去乙醚，真空干燥，得淡黃色粉末狀微球。繼續用雙蒸水洗滌，至有機溶劑洗凈，凍干。將200μl的bFGF溶液滴加在20mg的凍干明膠微球上，在室溫下保持30min以使bFGF完全融入微球。⁶⁰Co照射滅菌封存。將含有bFGF的微球樣本置于光鏡下，觀察其外形及分散度。同時測量500個微球的直徑計算其平均粒徑。以算術平均徑為微球的平均粒徑，計算公式為：平均粒徑=n1 d1+n2 d2+…+nn dn／n1+n2+n3+…+nn。式中n1，n2…nn為粒子數；d1，d2…dn為粒徑。

1．2．2 EGF-明膠微球的制備(同1．2．1)

1．3成纖維細胞的培養和實驗分組：標本取自手術剩余的健康全厚皮，剪去皮下和真皮深層組織，置2．0mg／L Dispase酶內4℃消化16h，剝離表皮放入37℃濃度為0．25％胰酶+EDTA的等量混合液中，消化5min，用含10％胎牛血清的DMEM終止胰蛋白酶作用。吸管吹散組織塊以獲取單個成纖維細胞。將懸浮細胞接種于25ml培養瓶，細胞密度為5×10⁵／瓶，置37℃，5％CO₂孵箱培養。待細胞融合成單層后再傳代培養備用。實驗分為四組：A組培養液為含體積分數10％小牛血清+20 ng／ml EGF、bFGF納米緩釋劑的DMEM；B組培養液為含體積分數10％小牛血清+20ng／mlEGF納米緩釋劑的DMEM；C組培養液為體積分數10％胎牛血清+20ng／mlbFGF納米緩釋劑的DMEM；D組培養液為體積分數10％胎牛血清+與A組等量的空白微球的DMEM(空白對照組)。

1．4緩釋EGF、bFGF微球對成纖維細胞數量的影響：取第2代培養的成纖維細胞，以1×10⁷／L接種于24孔板，使細胞同步生長后按實驗分組換成不同的培養液分別于培養1、3、5、7天收集細胞，每個時相點設4個重復測量孔，用血球計數板計數。實驗重復5次。

1．5緩釋EGF、bFGF微球對成纖維細胞活力的影響[四甲基偶氮唑鹽做反比色法(MTT法)：取第2代培養的成纖維細胞，以2×10⁷／L密度接種到96孔板，每孔200μl，使細胞同步生長后按實驗分組換成不同的培養液。分別于培養1、3、5、7天按常規先后加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜，每個時相點設4個重復測量孔，用酶標分析儀依次檢測每孔吸光度(A)值，檢測波長為570nm。實驗重復5次。

1．6緩釋EGF、bFGF微球對成纖維細胞周期的影響：取第2代培養的成纖維細胞，以2×10⁷／L密度接種到6孔板，每孔2ml。每組分別設1、3、7天3個時相點，每個時相點設4個重復測量孔，用ElitesP型流式細胞儀檢測細胞分裂周期，計算G₂／M+S期百分數。

1．7統計學分析：結果以x±s表示：采用SPASS 10．0軟件包進行統計分析和處理，四組均數間的比較采用t檢驗，多組均數間的比較采用單向方差分析(One-way ANOVA)。以ρ＜0．05為差異有顯著性意義。

2 結果

2．1 bFGF-明膠微球、EGF-明膠微球的表觀及平均粒徑：光鏡及掃描電鏡觀察可見制備的復合bFGF、EGF緩釋微球呈圓球體，球體均勻度好，大小較均勻。干燥狀態的微球表面有少許顆粒狀吸附物，但未見微孔和裂紋，圖(1～6，見中插1)。在掃描電鏡下測得微球粒徑呈正態分布，大部分為10～28μm，占89．6％，平均粒徑為(11．32±3．64)μm。凍干粉劑為淡黃色疏松粉末，無塌陷或萎縮現象；加雙蒸水后為淡黃色乳狀溶液，再分散性良好(如圖)。

2．2緩釋EGF、bFGF微球對成纖維細胞數量的影響：各組計數結果見表1。培養1天后，各組成纖維細胞數差異均無顯著性(F檢驗，ρ＞0．05)；3天時，各組成纖維細胞數比較：C組＞A組＞B組＞D對照組，但A、B兩組間差異無顯著性(q檢驗，ρ＞0．05)；培養5天后，緩釋微球A組細胞計數明顯高于對照組(q檢驗，ρ＞0．05)；7天后，A組值仍比其他組高，組間差異與5天時相仿。

2．3緩釋EGF、bFGF微球對成纖維細胞活力的影響：各組成纖維細胞A值的檢測結果見表2，培養1天后，各組A值間差異無顯著性(F檢驗，ρ＞0．05)；3天時，各組A值比較：A組＞C組＞B組＞D組，但前兩組間差異無顯著性(q檢驗，ρ＞P>0．05)；培養5天后，各組A值依次為：A組＞C組＞B組＞D組，緩釋微球組A值明顯高于對照組(q檢驗，ρ＜0．05)；7天后，各組A值問差異與5天時相仿。

2．4緩釋BFGF微球對成纖維細胞周期的影響：由表3可見，各組成纖維細胞的細胞周期檢測結果顯示：培養1天時，C組G₂／M+S期百分數高于A和B微球組，差異有顯著性意義(q檢驗，ρ＜0．05)；培養3天、7天時，A組G₂M+S期百分數高于B和C微球組，差異有顯著性意義(q檢驗，ρ＜0．05)。

3 討論

bFGF是一種具有廣譜作用的多肽因子，其細胞學效應包括：有絲分裂原、形態發生因子、趨化作用等。EGF是一種強力的細胞分裂促進因子，能促進細胞增殖、上皮再生和遷移以及血管形成；同時EGF還能刺激上皮細胞合成分泌膠原、透明質酸等細胞基質，促進結締組織細胞的生長。目前國內文獻中尚未見到有關人表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)納米緩釋劑的制備及其在慢性創面治療中的應用研究報道。

表皮生長因子(EGF)促進愈合作用的機制主要包括兩個方面：一是EGF作為強有力的趨化因子，能促進角質細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞等向受傷部位遷移；二是EGF作為有絲分裂原，可促進上述細胞的增殖。深二度燙傷創面的愈合涉及肉芽組織支架的形成和表皮細胞的修復。表皮生長因子(EGF)為有絲分裂刺激原，可以加快細胞分裂，促進增殖，還可改變細胞的趨化性，增加細胞遷移。

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的促修復作用是直接作用于其靶細胞(成纖維細胞與血管內皮細胞等)上特異性受體，并通過促分裂效應使這些細胞發生分裂增殖，進而啟動并加速修復進程。在皮膚創傷模型中，應用bFGF顯示了肉芽組織沉積增加，并伴隨著大量的多血管現象。bFGF促進了毛細血管增生，從而改善了局部微循環及組織營養狀況，肉芽組織迅速生長，創緣上皮向中心迅速爬行，促使創面愈合。

表皮生長因子亦為近年來的關注熱點，人們試圖通過上皮始祖細胞增殖的誘導作用促進皮膚創面的愈合，但實際效果受到了多種因素的限制。EGF促進肉芽組織生長和傷口愈合的作用已得到了廣泛的認可，但由于EGF是一種蛋白質性生長因子，如將其直接用于傷口可被組織中的蛋白酶分解，不能發揮持久作用。因此探討安全高效的EGF給藥方式，成為一個重要的研究內容。納米微囊包裹非病毒載體基因轉移技術是Kim Leong等人于1998年建立的，該技術較脂質體轉染方法具有更優越的基因轉移效率。納米微囊包裹可避免轉載物在受體內被溶酶體酶降解，同時由于采用可降解生物材料包裹，故能顯著提高轉載基因的活性并具有長時間緩釋功能。由于以上優點，利用EGF納米微球治療傷口愈合已成為一種重要的手段。彭湃等研究將納米微囊包裹重組質粒DNA真核表達載體pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF應用于創面后，其肉芽組織的生長明顯快于生理鹽水對照組，表明納米微囊包裹的重組VEGF基因內表達載體能在創面周圍穩定地釋放VEGF，促進新生血管的形成，加快傷口愈合。為本研究提供了一定的理論依據。

目前應用bFGF、EGF的主要困難是給藥途徑。緩釋微球載體作為新型藥物緩釋控釋系統之一，具有許多優越性，可緩釋藥物、靶向輸送、在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量以及降低藥物毒性等。明膠屬于天然高分子生物材料，通常從動物膠原經水解提煉，在水中久浸可吸水膨脹或軟化，機體內組織相容性好，能被組織吸收。明膠在未吸水前耐高溫，可高溫消毒；吸水膨脹軟化后，溶點也不超過30℃。此外，明膠還具有價廉易得、無抗原性、摩擦系數低、在體內可自然降解等優點，已廣泛用于多種藥物劑型中。明膠是氨基酸與肽類交聯形成的直鏈聚合物，能進行多種表面修飾及反應，制備時可根據不同要求設計。而且，明膠微球為實體微粒，被包裹藥物釋放相對緩慢，足以達到緩釋的要求。明膠微球最大優點是對堿性和酸性生長因子都能包裹。

微球制備采用改良的乳化冷凝法，其機制是等電點為5．0的酸性明膠在水中溶解后，分子伸展為纖維狀，在冷凍脫水的條件下卷曲，并由多個分子凝聚成球狀微粒，在固化劑(戊二醛)的作用下，明膠分子呈穩定性良好的三維網狀結構，并與荷電性相反的堿性bFGF通過離子間的相互作用形成較為穩定的PECs，兩者間形成一定的親和力，bFGF被明膠吸附并包裹于微球中，隨著明膠的降解，實現bFGF在體內的控制釋放。我們經過多次試驗，對舊工藝作了改進。為克服以往技術制備的微球在水性環境中溶解速度較快的缺點，采用交聯固化手段延緩生長因子的釋放。在制備過程中對微球進行預固化，提高微球的成形率。本實驗采用戊二醛作固化劑，在中性介質中將微球交聯。為避免固化后粘連，選擇異丙醇環境，固化好后用2％氨基乙酸洗滌過量戊二醛，再用異丙醇和乙醚洗。此方法固化所得微球外形圓整，分散性好，包封率較高。此外，采用多級濾網可以將緩釋微球按要求篩分為一定直徑的產品，滿足微球與不同孔隙率的組織工程支架結合的需要。

復合bFGF、EGF緩釋微球對成纖維細胞數量和活力影響的實驗結果是：培養1天后各組細胞計數、吸光度(A)值差異均無顯著性；5天后，復合緩釋微球組細胞計數、吸光度(A)值明顯高于對照組；7天后，復合緩釋微球組值仍高于其他組但差異無顯著性。表明使用bFGF、EGF的最初24h無明顯作用；培養初期，bFGF組、EGF組中游離的bFGF、EGF數量多于復合緩釋微球組釋放的bFGF、EGF，所以，bFGF組促分裂作用最強；培養5天后，bFGF組及EGF組的大部分游離bFGF、EGF失去活性，而緩釋微球組持續釋放具有生物活性的bFGF、EGF，因此，后者的促分裂作用最強：培養7天后，雖然緩釋微球組仍在釋放bFGF、EGF，但速度已經減慢，而最初釋出的部分bFGF、EGF生物活性受到了破壞，因此各組之間的促分裂作用無顯著差異。空白對照組的結果也顯示，微球成分對成纖維細胞數量和活力無影響。因此，本研究證明了復合bFGF、EGF緩釋微球對成纖維細胞數量和活力的影響明顯優于對照組。我們認為，應進一步實驗以證明能否通過改變明膠微球的粒徑來延長或縮短微球的降解時間及BFGF、EGF的釋放速率，以期更好地滿足長時期內促成纖維細胞增殖的需要。

我們經過多次試驗，克服了以往技術制備的微球在水性環境中溶解速度較快的缺點，采用交聯固化手段延緩生長因子的釋放。復合bFGF、EGF緩釋微球對成纖維細胞數量和活力影響的實驗結果是下一步進行動物實驗的重要基礎和依據。

[收稿日期]2006-09-20 [修回日期]2006-11-28

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。