高效液相色譜法測定茶葉中12種有機酸的研究

茶葉中有機酸的含量約為茶葉干物質(zhì)總量的3%^[1] ，其作為茶樹中多種代謝途徑的聯(lián)系紐帶，與多種品質(zhì)成分的代謝相關，定性和定量分析有機酸對茶葉品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。常用的有機酸檢測方法主要有高效液相色譜法[3-4、氣相色譜法[]、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[79]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、電位滴定法[1]、毛細管電泳法等，其中高效液相色譜法具有分離效果好、重現(xiàn)性高等優(yōu)點[1I-12]。本研究擬建立一種簡單、快速測定酒石酸、草酸、甲酸、奎尼酸、L-蘋果酸、丙酮酸、乙酸、乳酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸和水楊酸等茶葉中常見有機酸的高效液相色譜分析方法，并測定六大茶類及茉莉花茶樣品中各有機酸組分的含量，以期為茶葉中有機酸組分相關研究和檢測方法標準的制定奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料

實驗所用的茶葉樣品來源于雅安市質(zhì)量檢驗檢測院2024年的委托檢驗樣品，具體信息見表1；實驗用水為超純水。

標準物質(zhì)：酒石酸、乙酸 （1000μg/mL） ，購自鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司；草酸（ ，L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、水楊酸（ 100mg/fi ），甲酸（ 1000μg/mL ），均購自壇墨質(zhì)檢－標準物質(zhì)中心；奎尼酸（ ），購自上海詩丹德標準技術(shù)服務有限公司；丙酮酸、富馬酸、琥珀酸 ，購自北京曼哈格生物科技有限公司。

主要試劑與耗材：甲醇（色譜純）、磷酸（分析純），購自成都市科隆化學品有限公司；磷酸二氫鉀（ KH₂PO₄ ，分析純），購自成都金山化學試劑有限公司； 0.22μm 水性濾膜針頭濾器，購自江蘇綠盟科學儀器有限公司； Acclaim^TM120C₁₈ 液相色譜柱（ 5μm ， 4.6mm×250mm ），購自賽默飛世爾科技公司。

1.2主要儀器設備

高速萬能粉粹機（FW400A），購自北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司；電子天平（ALC-110.4），購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫干燥箱（DX412C），購自日本雅馬拓公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S），購自江蘇正基儀器有限公司；靜音智能超聲波清洗器（KS-500XDS），購自昆山潔力美超聲儀器有限公司；精密pH計（S210），購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜儀（ 1260Infini ty，含二極管陣列檢測器），購自美國安捷倫公司；超純水器（GWB-2T），購自北京普析通用儀器有限責任公司。

表1茶葉樣品信息

1.3試驗方法

1.3.1有機酸標準溶液的配制

按表2有機酸標準儲備溶液質(zhì)量濃度要求，分別準確吸取（稱?。┚剖?、甲酸、奎尼酸、草酸、L-蘋果酸、丙酮酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、富馬酸、水楊酸標準物質(zhì)于 10mL 容量瓶中，用超純水定容，配制單一有機酸標準儲備溶液；乙酸直接使用 1000μg/mL 的標準物質(zhì)。各單一標準儲備溶液于 4^°C 冰箱冷藏保存。

表2單一有機酸標準儲備溶液的質(zhì)量濃度

分別準確移取相應體積的上述有機酸單一標準儲備溶液于同一 50mL 容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，混勻，配制12種有機酸的混合標準溶液，其中草酸、酒石酸、奎尼酸、甲酸、丙酮酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和水楊酸的質(zhì)量濃度分別為40.00、40.00、80.00、40.00、20.00、100.00、100.00、100.00、80.00、0.40、100.00、 1.00μg/mL ；分別準確移取相應體積的該混合標準溶液于容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，配制不同質(zhì)量濃度梯度的有機酸混合標準使用溶液（表3），現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2樣品前處理

稱取 3g （準確至 0.001g ）磨碎試樣于 500mL 錐形瓶中，加沸純水 450mL ，立即移入沸水浴中，浸提 45min （每隔 10min 搖動1次），浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，將濾液轉(zhuǎn)入 500mL 容量瓶中，冷卻后用純水定容至刻度，搖勻[13]，用0.22μm 水性濾膜針頭濾器過濾后進高效液相色譜儀測定。

1.3.3高效液相色譜條件

選用AcclaimTM 120C₁₈ 液相色譜柱，柱溫30^°C ，以甲醇（A）和 0.1mol/LKH₂PO₄ 溶液（B）為流動相進行梯度洗脫，程序如下： 0～12min 1% A； 12～15min ，從 1% A逐步提高到 50% A;15～25min ， 50% A； 25～27min ，從 50% A逐步降低到 1% A； 27～30min ， 1% A； 0.1mol/L KH₂PO₄ 的配制方法為：稱取 13.6gKH₂PO₄ 于燒杯中，加接近1L的超純水溶解，用 H₃PO₄ 調(diào)節(jié)pH至2.7后，轉(zhuǎn)移到1L的容量瓶中，用純水定容并搖勻后，用 0.45μm 水系濾膜過濾至流動相瓶，超聲 10min ；二極管陣列檢測器檢測波長為 210nm ，進樣量為 30μL 起始流速為 1.2mL/min 0～12min 流速從 1.2mL/min 逐步降低至 1.0mL/min ； 12～ 30min ，流速保持在 1.0mL/min^[14] 。

μg/mL

表3有機酸標準使用溶液的質(zhì)量濃度

μg/mL

1.3.4線性關系、檢出限、定量限和回收率計算

按1.3.3的高效液相色譜條件，將表3中5個質(zhì)量濃度的有機酸標準使用溶液分別進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。選擇表1中序號為5的粉碎茶樣，按1.3.2的樣品前處理方法和1.3.3的高效液相色譜條件，用信噪比 S/N=3 時的質(zhì)量濃度計算方法檢出限；用信噪比 S/N=10 時的質(zhì)量濃度計算方法定量限；加標后經(jīng)樣品前處理的待測液稀釋1倍后進樣測定，計算回收率。

1.3.5精密度試驗

選擇表1中序號為5的粉碎茶樣，按1.3.2的樣品前處理方法進行樣品前處理后，按1.3.3的高效液相色譜條件連續(xù)進樣6次，計算各有機酸峰面積的相對標準偏差（RSD）。

1.3.6重復性試驗

選擇表1中序號為5的粉碎茶樣，分別按1.3.2的樣品前處理方法制備6份重復樣品，按1.3.3的高效液相色譜條件分別進樣，計算各有機酸峰面積的RSD。

1.3.7茶葉樣品中各有機酸含量的測定

對表1中的所有茶樣按1.3.2進行樣品前處理后，按1.3.3的高效液相色譜條件測定茶樣提取液中草酸、酒石酸、奎尼酸、甲酸、丙酮酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和水楊酸的含量，若試樣溶液中某組分的質(zhì)量濃度超過標準使用溶液質(zhì)量濃度的最高點時，需將待測液稀釋后進樣。同時按《食品安全國家標準食品中水分的測定》（GB5009.3—2016）[15]對茶樣的水分含量進行測定。

2結(jié)果與分析

2.1流動相的選擇

有機酸在水中很容易發(fā)生電離，因此一般會使用pH值較低的酸性流動相來抑制有機酸的離解，一般選擇在紫外區(qū)幾乎無吸收的磷酸鹽溶液作為流動相[]，在流動相中添加適量的甲醇可有效改善峰形，有利于有機酸組分的分離[。本研究分別以甲醇、乙腈為流動相A，以磷酸水溶液、NH₄H₂PO₄ 、 KH₂PO₄ 、 ΔNaH₂PO₄ 為流動相B，分別調(diào)節(jié)pH值為2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9，結(jié)果表明，以甲醇為流動相A，以pH值為2.7的 0.1mol/L KH₂PO₄ 為流動相B進行梯度洗脫時，各有機酸組分分離較好且峰形對稱。

2.2線性關系、檢出限、定量限和回收率

從12種有機酸標準物質(zhì)的高效液相色譜圖（圖1）可見，除水楊酸外，其余11種有機酸的出峰時間均在 9min 內(nèi)，表明該方法可在 9min 內(nèi)完成11種有機酸的檢測。根據(jù)檢測結(jié)果計算12種有機酸的線性關系、檢出限、定量限和回收率，結(jié)果（表4）表明，各有機酸在一定范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關系，各有機酸的線性相關系數(shù)均達到0.999，線性良好，各有機酸的方法檢出限為 0.001～0.300mg/g ，方法定量限為0.003～1.000mg/g ，回收率為 91.8%～103.5% 。

圖112種有機酸標準物質(zhì)的高效液相色譜圖

表412種有機酸的線性關系、檢出限、定量限和回收率

2.3精密度試驗

選取序號為5的蒙頂黃芽樣品進行連續(xù)進樣6次，各有機酸組分的峰面積見表5。在該樣品中未檢出酒石酸和乳酸，其余10種有機酸峰面積的RSD在 0.730%～1.990% 之間，表明該方法的精密度良好。

2.4重復性試驗

選取序號為5的蒙頂黃芽6份重復樣品進行連續(xù)檢測，各有機酸組分的峰面積見表6。在該樣品中未檢出酒石酸和乳酸，其余10種有機酸峰面積的RSD在 0.780%～2.940% 之間，表明該方法的重復性良好。

2.5樣品的測定

茶葉樣品的高效液相色譜圖如圖2所示（以5號樣品為例）。對各茶樣中的12種有機酸含量進行測定，結(jié)果見表7。各茶樣中含量較高的有機酸有L-蘋果酸、奎尼酸、乙酸，其含量范圍分別為4.70～30.25 、 8.36～25.75 、 3.98～28.80mg/g ，其中L-蘋果酸含量最高的茶樣為蒙頂山紅毛尖，奎尼酸含量最高的茶樣為緊壓白牡丹，乙酸含量最高的茶樣為蒙頂黃芽；黃茶和白茶的草酸含量較高，紅茶和烏龍茶中的乳酸含量較高，紅茶中的琥珀酸含量較高。

表5精密度試驗的峰面積

注：“—”表示受檢測儀器和檢測方法限制，該組分含量無法檢出，下同。

表6重復性試驗的峰面積

圖2茶葉樣品的高效液相色譜圖

表7茶葉樣品中各有機酸的含量

3小結(jié)與討論

茶葉基質(zhì)復雜，現(xiàn)行《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》（GB5009.157—2016）中的檢測方法適用范圍并不包括茶葉[7。本研究建立了一種簡單、快速測定茶葉中L-蘋果酸、奎尼酸、乙酸等12種有機酸的高效液相色譜分析方法，該方法在 9min 內(nèi)能完成除水楊酸外11種有機酸的測定，而現(xiàn)有的茶葉中有機酸檢測方法測定的有機酸組分基本在10種以內(nèi)[18]。

本研究考察了線性關系、檢出限、定量限、回收率、精密度、重復性，并采用該方法測定了六大茶類及茉莉花茶樣品中各有機酸組分的含量。各茶樣中含量較高的有機酸主要包括L-蘋果酸、奎尼酸和乙酸。氨基酸在熱反應條件下可發(fā)生脫氨反應，生成氨和相應的有機酸，例如天冬氨酸脫氨可生成蘋果酸[1]。此外，蘋果酸還可通過琥珀酸在琥珀酸脫氫酶和延胡索酸酶的催化下合成[20]。奎尼酸作為綠原酸合成的前體物質(zhì)，存在于莽草酸代謝途徑中，茶樹幼葉中含有大量奎尼酸。在茶葉加工過程中，脫氫奎尼酸在奎尼酸脫氫酶的作用下可轉(zhuǎn)化為奎尼酸，使其含量上升[2]。乙酸是茶葉香氣的重要組成成分之一。已有研究證實，乙酸是白茶、黃茶中主要有機酸之一[22-23]。

現(xiàn)有研究尚未對茶葉有機酸進行全面、系統(tǒng)地評價，本研究建立的高效液相色譜分析方法可用于茶葉中有機酸的快速測定，采用的前處理方法也可應用于對茶葉中的游離氨基酸和咖啡堿含量進行測定，從而節(jié)約了檢測成本，提高了檢測效率，可為茶葉品質(zhì)研究和茶葉中有機酸檢測方法標準的制定奠定基礎。

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