乳腺癌術后服用他莫昔芬患者子宮內膜中PTEN 的表達

李羽禾 何 玥 吳玉梅

首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦瘤科，北京 100006

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發生率及死亡率高，約有60%～80%的乳腺癌患者雌激素受體和/或孕激素受體陽性［1］，他莫昔芬（TAM）是雌激素受體和/或孕激素受體陽性的絕經前乳腺癌患者的一線輔助治療用藥［2］，但長期服用可增加子宮內膜病變及癌變風險，但發生機制尚不清楚。PTEN（第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因）是子宮內膜癌中突變率最高的基因，被公認為是子宮內膜的“看家基因”［3］。故本研究選取乳腺癌術后服用TAM 患者，以Ⅰ型子宮內膜腺癌患者及正常子宮內膜為對照，采用免疫組化法檢測PTEN 蛋白的表達。旨在探討PTEN 是否參與乳腺癌術后服用TAM 相關的子宮內膜病變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1～12 月首都醫科大學附屬北京婦產醫院（以下簡稱“我院”）隨診的乳腺癌術后服用TAM（20 mg/d）的患者56 例。其中因陰道不規則出血或定期隨訪B 超提示子宮內膜異常增厚，住院行宮腔鏡診刮術獲得子宮內膜標本的患者10 例，擬定為乳腺癌術后服用TAM 組；因“宮頸上皮內瘤變Ⅲ級或子宮肌瘤”行全子宮切除術的正常子宮內膜患者10 例，擬定為正常子宮內膜組；初治的Ⅰ型子宮內膜腺癌患者10 例，擬定為子宮內膜癌組。其中正常子宮內膜組及子宮內膜癌組為對照組。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

納入標準：①乳腺癌術后服用TAM 超過6 個月且患者病例資料完整；②患者知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①6 個月內曾服用其他內分泌治療藥物；②合并其他惡性腫瘤；③曾行放化療及免疫治療者。

1.2 方法

1.2.1 試劑 他莫昔芬（上海華聯制藥公司，批號：H10910072），兔抗人PTEN 多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號：ab31392）。S-P 譜超敏試劑盒（邁新生物有限公司，批號：1806073825），二氨基聯苯胺（DAB）酶底物顯色劑（邁新生物有限公司，批號：180508441C），使用XDS-100 倒置熒光顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）進行觀察。

表1 三組患者的一般資料比較

1.2.2 標本制作 乳腺癌術后服用TAM 組、正常子宮內膜組及子宮內膜癌組中PTEN 蛋白在子宮內膜組織中的表達情況采用免疫組化染色法測定。子宮內膜組織離體后放入甲醛溶液（同和生物，批號：18032401）固定，石蠟包埋、切片、常規脫蠟、水化、孵育、抗原修復，連續切片，切片厚度4 μm，每例切片6 張。隨后按照免疫組化試劑盒所示步驟進行，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水，封片。

1.3 觀察指標

PTEN 蛋白陽性表達為棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細胞質中，偶可見于細胞膜和/或細胞核。每例均隨機觀察5 個高倍視野。PTEN 蛋白定量表達采用半定量積分法；定性表達采用主觀分級記錄，染色強度評分：陰性為0 分，弱強度為1 分，中等強度為2 分，高強度為3 分；染色陽性率評分：陽性率≤5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%～100%為4 分。總評分=染色強度評分×染色陽性率評分，0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中度陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料采用百分率表示，采用Fisher 精確概率法；符合正態分布計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態分布的計量資料改用中位數（M）和四分位數（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗及Kruskal-Wallis H 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN 蛋白染色情況

三組PTEN 蛋白主要位于腺上皮細胞的細胞質中。正常子宮內膜組，細胞質中棕黃色顆粒分布均勻，未見缺失，見圖1A；子宮內膜癌組，細胞質中棕黃色顆粒均較正常，見圖1B；乳腺癌術后口服TAM 組，細胞質中棕黃色顆粒明顯減少，部分細胞棕黃色顆粒呈缺失狀態，見圖1C。

2.2 三組PTEN 蛋白定量表達情況

三組PTEN 蛋白定量表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；子宮內膜癌組PTEN 蛋白低于正常子宮內膜組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組PTEN 蛋白定量表達情況［分，M（P25，P75）］

2.3 三組PTEN 蛋白定性表達情況

子宮內膜癌組表達強度低于正常子宮內膜組，乳腺癌術后服用TAM 組表達強度低于正常子宮內膜組。見表3。

表3 三組PTEN 蛋白定性表達情況（例）

3 討論

3.1 乳腺癌國內外進展及內分泌治療情況

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。在中國，乳腺癌的死亡率逐年上升，嚴重威脅女性的生命和健康，成為社會的巨大負擔［4-7］。乳腺癌治療方式有手術聯合放化療、內分泌治療、靶向治療等。雌激素受體陽性的乳腺癌患者，內分泌治療占有十分重要的地位。TAM是一種選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，用于乳腺癌治療已超過30 年，是非常有效的乳腺癌術后一線輔助治療藥物，可顯著降低乳腺癌的復發風險［8-12］。2018 年NCCN 乳腺癌指南［13］推薦，絕經前首選TAM治療5 年，如仍未絕經，則繼續使用至10 年，顯著降低復發率和死亡率［14］。

長期服用TAM 后月經多不規律，甚至絕經，體內呈現低雌激素狀態。TAM 有弱雌激素作用，隨著服用時間的增加，劑量累積，可引起一系列婦科病變，包括子宮內膜增生、息肉、肉瘤和癌變［15-17］。TAM 相關子宮內膜癌患者病理級別通常為更高級別，臨床預后較差［18］，但具體機制尚無定論，因此了解其分子機制對于制訂治療策略并減少TAM 對子宮內膜的影響至關重要。明確TAM 相關子宮內膜病變的早期分子標志物，可有效預測子宮內膜病變的發生，為進一步研究打下基礎。

3.2 PTEN 與子宮內膜癌的相關性

目前Ⅰ型子宮內膜癌最常見的分子標志物有5 種，包括PTEN、PIK3CA、K-ras、β-catenin。PTEN 是10 號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因［19］，屬于抑癌基因，是Ⅰ型子宮內膜癌中發現的最早和最常見的遺傳改變之一，被稱做子宮內膜的“看家基因”［20］。PTEN 可通過調控細胞內PIP3 含量從而調控細胞生長。PIP3 位于細胞膜，是細胞生長調控的重要通路之一，活化的PIP3 可激活細胞周期蛋白依賴激酶，使細胞從G1期進入S 期，促進細胞生長及增殖。PTEN 有脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，使PIP3 去磷酸化，降低細胞內PIP3 水平，從而使細胞停止在G1期，阻止細胞生長，誘導細胞凋亡［21］。PTEN 在Ⅰ型子宮內膜癌中的突變率為35%～83%，在至少20%的子宮內膜癌前病變中功能完全喪失或突變［22-23］。提示PTEN 表達缺失不僅限于子宮內膜癌，在子宮內膜增生中就已存在，是Ⅰ型子宮內膜癌的早期分子事件［16］。本研究對Ⅰ型子宮內膜癌組織進行免疫組化檢測，發現細胞質中棕黃色顆粒明顯減少，部分完全缺失；半定量積分法發現，子宮內膜癌組PTEN 蛋白表達量低于正常子宮內膜組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.3 乳腺癌術后服用TAM 導致子宮內膜病變可能的分子機制

越來越多學者致力于研究PTEN 與TAM 導致子宮內膜病變的相關性，Holtz 等［23］研究顯示，在有乳腺癌史的子宮內膜癌患者中，服用TAM 與未服用TAM患者的子宮內膜組織中PTEN 蛋白表達無明顯差異。Prasad 等［24］研究顯示，在有乳腺癌史的女性中，與TAM相關子宮內膜癌含有與散發性子宮內膜癌相似的遺傳改變，為TAM 導致子宮內膜病變可能的分子機制提出了新思路。郭蕾等［25］研究發現，絕經期婦女服用TAM，PTEN 外顯子突變率明顯高于正常組，而與子宮內膜癌組差異無統計學意義，提出PTEN 可能是TAM導致子宮內膜病變的早期分子事件。本研究中，三組PTEN 蛋白定量表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示TAM 的弱雌激素作用，使得子宮內膜長期處于增殖狀態，引起PTEN 蛋白表達進一步減少，導致子宮內膜病變；乳腺癌術后服用TAM 組與正常子宮內膜組中PTEN 蛋白表達比較，差異無統計學意義，可能是由于樣本量較小，差異不明顯所致；且PTEN 蛋白定性分析顯示乳腺癌術后服用TAM 組PTEN 蛋白表達強度有明顯降低趨勢。

綜上所述，服用TAM 可能出現PTEN 蛋白的表達逐漸減少，影響相關通路，使子宮內膜呈持續增生改變，進而發展為子宮內膜癌。馬雪蓮等［26］研究指出，TAM 通過效應分子miR-1297 的異常表達發揮作用，引發其下游靶基因PTEN 的表達發生改變，致使P13K/P-ATK 途徑激活，P-ATK 表達上調，細胞異常增殖，逃逸凋亡，導致子宮內膜異常增生、發生癌變。本研究局限性在于樣本量較少，將會開展更大樣本的研究，專注于PTEN 與TAM 相關子宮內膜病變之間的關系及具體機制。明確TAM 相關子宮內膜病變機制，即可為下一步研究打下基礎，亦可指導乳腺癌內分泌治療的臨床用藥。