U87MG-Luc裸鼠膠質母細胞瘤原位模型建立

[摘要] 目的 探討利用U87MG建立穩定表達螢光素酶的細胞系，并建立裸鼠膠質母細胞瘤腦原位移植瘤模型，為抗膠質母細胞瘤藥物提供合適的藥效評價模型。方法 采用慢病毒感染U87MG方法制備穩定高表達螢光素酶的U87MG細胞系（U87MG-Luc），并反復傳代驗證其穩定性。利用腦立體定位儀和微量恒流泵將體外擴增、消化處理的U87MG-Luc單細胞懸液輸注入裸鼠右腦尾狀核區。利用小動物活體成像技術觀察接種的U87MG-Luc成瘤和腫瘤生長情況，確認合適的造模條件。隨后利用構建的U87MG-Luc腦原位癌模型，驗證臨床一線治療藥物替莫唑胺的療效，包括腫瘤生長狀態、動物體質量、生存期等指標。結果 用慢病毒感染系統成功建立并篩選到U87MG-Luc穩定細胞株；穩定株表達的螢光素酶與細胞接種密度呈線性關系，且該體外培養連續傳代至第21代仍能穩定表達螢光素酶。裸鼠腦內接種合適濃度的U87MG-Luc細胞后可腦原位成瘤，以2×10⁵個細胞/裸鼠接種成功率高（100%），接種后第5天腦穩定成瘤且無轉移，隨后腫瘤生長趨勢良好。本研究構建的U87MG-Luc腦原位癌模型中，替莫唑胺可顯著抑制腫瘤生長，延長荷瘤裸鼠的生存期（Plt;0.001）。結論 基于慢病毒表達系統成功構建、轉導和篩選出穩定高表達螢光素酶的U87MG-Luc細胞株，并構建U87MG-Luc裸鼠腦原位癌模型，為抗膠質瘤藥物研發提供合適的藥效評價模型。

[關鍵詞] 膠質母細胞瘤；動物模型；替莫唑胺；裸鼠

[中圖分類號] R739.41" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.25.004

Establishment of an in situ tumor model of U87MG-Luc glioblastoma in nude mice

WANG Yazhou¹， HU Jianfeng²， LIU Yijia²， TONG Yuxuan²

1.GCP Office， Liuzhou Worker’s Hospital， Liuzhou 545000， Guangxi， China; 2.Department of Biological Evaluation， Neurodawn Pharmaceutical Co. Ltd.， Nanjing 210009， Jiangsu， China

[Abstract] Objective To establish a stable cell line expressing luciferase using U87MG cells， and to establish a nude mouse glioblastoma in situ transplantation tumor model， in order to provide a suitable efficacy evaluation model for anti-glioblastoma drugs. Methods A stable and highly expressing luciferase U87MG cell line （U87MG-Luc） was prepared by infecting U87MG with lentivirus， and its stability was verified by repeated passages. U87MG-Luc single-cell suspension， which has been amplified and digested in vitro， was injected into the caudate nucleus of the right brain of nude mice using a brain stereotaxic device and a micro constant flow pump. Using small animal live imaging technology to observe the tumor formation and growth of U87MG-Luc inoculated， and confirm appropriate modeling conditions. Subsequently， the U87MG-Luc brain in situ tumor model was constructed to validate the efficacy of the first-line clinical treatment drug temozolomide， including indicators such as tumor growth status， animal weight， and survival time. Results Successfully established and screened U87MG-Luc stable cell line using lentiviral infection system. The luciferase expressed by stable strains was linearly related to cell seeding density， and the in vitro culture could stably express luciferase after continuous passage to the 21st generation. After inoculating U87MG-Luc cells at an appropriate concentration into the brain of nude mice， in situ brain tumor formation was achieved， with a high success rate （100%） of 2 × 10⁵ cells/nude mouse. On the fifth day after inoculation， the brain tumor remained stable with no metastasis， and the tumor growth trend was good thereafter. In the U87MG-Luc brain in situ tumor model constructed in this study， temozolomide significantly inhibited tumor growth and prolonged the survival of tumor bearing nude mice （Plt;0.001）. Conclusion" A stable and highly expressing luciferase U87MG-Luc cell line was successfully constructed， transduced， and screened based on the lentiviral expression system， and U87MG-Luc nude mouse brain in situ tumor model was constructed to provide a suitable pharmacological evaluation model for the discovery of anti-glioma drugs.

[Key words] Glioblastoma; Animal model; Temozolomide; Nude mice

膠質母細胞瘤是最常見的顱內惡性腫瘤之一，也是膠質瘤中惡性程度最高的一種，約占所有膠質瘤患者的54%，占所有原發性惡性中樞神經系統腫瘤患者的50.9%^[1-3]。盡管膠質母細胞瘤的多模式治療取得進展，但總體預后仍然較差，長期生存率低，5年生存率僅約6.9%^[1，3-5]。膠質母細胞瘤臨床前動物模型在很大程度上影響藥物開發的速度和質量。選擇合適的動物模型能快速有效地篩選藥物進入臨床研究階段，且能更準確評估藥物的臨床藥效。U87MG是一種體外研究常用的人源膠質母細胞瘤細胞系^[6]。該細胞是單克隆來源的均質化細胞群，不具備臨床膠質母細胞瘤的高度異質性。在U87MG細胞中，PTEN基因失活，不攜帶P53、IDH1突變，這與臨床并不一致。但U87MG攜帶有與人膠質母細胞瘤一致的PTEN、hTERT和ATRX突變及MGMT甲基化^[7]；且該類細胞系易于培養，可較好地模擬人膠質母細胞瘤組織病理情況，與人膠質母細胞瘤有較大相似性，利用該類細胞建立免疫缺陷動物原位瘤模型可更好地滿足藥物臨床前藥效快速篩選，藥代動力學–藥效動力學研究及藥物與放療聯合應用的機制研究需求。本研究建立U87MG細胞穩定的螢光素酶報告體系并建立裸鼠腦原位瘤移植模型，通過活體成像技術監測動物腫瘤生長狀態，并利用替莫唑胺進行藥效驗證以探究模型預測效度。

1" 材料與方法

1.1" 主要儀器與試劑

人膠質母細胞瘤細胞U87MG購自南京科佰生物技術有限公司（貨號CBP60299）；PLVX-Luc-puro質粒通過將LUC2基因片段克隆入PLVX-PURO載體（EcoRI和BamHI雙酶切）獲得；PLVX-PURO載體、慢病毒包裝質粒Lenti-X HTX Packaging Mix、P24 Rapid titer kit購自Clontech公司（貨號632200）；Bright-glo luciferase檢測試劑購自Promega公司（貨號E2610）；293T/17細胞購自南京科佰生物技術有限公司（貨號CBP60440）；Luciferase一抗、β-actin一抗、二抗來自于CST公司（貨號分別為25039、4967、7074）；MEM培養基、DMEM培養基、0.05%胰蛋白酶、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、脂質體3000、DNA Marker購自Thermofisher公司；磷酸鹽緩沖液、嘌呤霉素、D-螢光素鉀鹽、一抗稀釋液、二抗稀釋液購自上海碧云天生物技術有限公司；一步制膠試劑盒、預染蛋白Marker購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；多功能酶標儀、化學發光成像儀、高速低溫離心機、核酸定量儀、細胞計數儀、倒置熒光顯微鏡、CO₂細胞培養箱、臺式離心機、電子分析天平、高壓蒸汽滅菌鍋、立體定位儀、氣體麻醉儀、微量注射泵、小動物活體成像儀。

1.2" 實驗動物及飼養

BALB/nude裸鼠購自上海靈暢生物科技有限公司。生產許可證號：SCXK（滬）2018-0003；合格證20180003030021。實驗動物飼養于南京拉姆達醫藥有限公司SPF級動物房[實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0040]。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準（倫理審批號：IACUC-20221106）。飼養密度5只/籠，飼養環境溫度20～26℃（日溫差≤4℃）；飼養環境濕度：相對濕度40%～70%。人工照明，12h明暗交替（7點開燈，19點關燈）。

1.3" 細胞培養及細胞系構建

1.3.1" 慢病毒包裝" 復蘇293T/17細胞并正常培養傳代2～3次，培養體系為DMEM+10%胎牛血清。轉染前，確認細胞匯合度在70%～90%。而后按脂質體LTX轉染試劑說明和慢病毒包裝質粒說明書操作方法，將慢病毒質粒與慢病毒包裝質粒共轉染至293T/17細胞。培養72h后收集含慢病毒的細胞上清，3000轉/min、4℃離心10min，取上清。慢病毒上清液0.22μm過濾，去除各種細胞與碎片，收集濾液。

1.3.2" 慢病毒濃縮與滴度測定" 將上述過濾后的濾液吸入至100kDa分子量超濾管，3000轉/min、4℃離心60min，進一步濃縮病毒液。而后用P24 Rapid titer kit測定慢病毒滴度，操作方法參考試劑盒的使用說明書。

1.3.3" U87MG細胞慢病毒感染" U87MG細胞復蘇后培養于完全培養基，正常傳代2～3次，確保細胞狀態良好。感染前一天，取處于對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化后重懸，接種至24孔板。24h后，每孔加入5mg/ml Polybrene溶液1μl，輕輕混勻。每孔留25μl培養基，根據MOI=30（MOI=慢病毒體積×慢病毒滴度/感染細胞數）加入PLVX-Luc-puro慢病毒，輕輕混勻。37℃感染4h，4h后補齊完全培養基至500μl。感染24h后，棄去含慢病毒的培養液，更換新鮮的完全培養液，繼續培養。

1.3.4" 細胞抗性篩選" 取500ml U87MG完全培養基，加10mg/ml嘌呤霉素100μl制成篩選培養基。慢病毒感染48h后吸去24孔板內細胞上清，每孔加入500μl 37℃預熱的篩選培養基培養細胞。細胞每3d更換新鮮的篩選培養基一次。當細胞密度達80%～90%時，按1∶3的傳代比例進行傳代培養，抗性篩選持續2周。將抗性篩選獲得的穩定細胞株逐漸傳代擴增。

1.3.5" 細胞螢光素酶檢測" 擴增培養U87MG-Luc細胞。按照實驗需求每孔接種一定數量U87MG細胞，而后每孔加入100μl Bright-Glo luciferase試劑或50μl D-螢光素鉀鹽溶液（30mg/ml）混勻，反應3min，酶標儀測定信號或化學發光成像儀拍攝"" 圖片。

螢光素酶蛋白表達采用蛋白質印跡法：細胞預先接種于孔板中，生長至合適密度后棄培養基并加入細胞裂解液后放置在冰上開始裂解。用細胞刮收集細胞裂解液后金屬浴100℃加熱。將凝膠固定于電泳槽中，加入電泳緩沖液，將上述收取的細胞樣品及預染蛋白Marker按順序加入上樣孔中，于恒壓條件進行電泳。電泳結束后膠轉移至轉膜夾，將固定好的轉膜夾放置于轉膜槽中，加入適量轉膜液，恒流轉膜。轉膜結束將膜放置在封閉液中孵育1h，并在封閉結束后用TBST清洗3次，隨后將膜進行一抗及二抗孵育。將ECL發光液A液與B液以1∶1比例混勻，再將完成抗體孵育的膜蘸取發光液后用化學發光成像儀曝光成像。

1.4" 原位荷瘤裸鼠建立

1.4.1" 細胞懸液制備" 大量擴增U87MG-Luc細胞以滿足模型制備需求。待培養瓶內細胞密度達到70%～80%時，消化細胞并用一定體積磷酸鹽緩沖液重懸，最終細胞懸液濃度為4×10⁷個/ml，放置冰上備用。立體定位注射前需將細胞懸液用移液器輕輕吹勻防止細胞發生沉降。

1.4.2" 立體定位注射" 實驗器械處理：在手術開始之前，手術所用器械均須經高壓蒸汽滅菌，不能高溫滅菌的手術用品需經75%醫用酒精擦拭或浸泡，并用紫外滅菌燈照射30min。手術操作臺面（超凈臺）需經酒精擦拭且經紫外滅菌燈照射30min。動物處理：選用8周齡雄性裸鼠。首先將選好的動物用氣體麻醉儀進行麻醉，觀察麻醉后動物狀態是否良好，呼吸是否均勻。隨后將麻醉好的動物固定于立體定位儀上，手術全程利用軟管保持異氟烷麻醉劑吸入，維持動物麻醉狀態。手術過程：用碘伏、醫用酒精消毒裸鼠頭皮后，于裸鼠內眥連線與頭部矢狀中線交匯處用手術刀縱向切開，切口約0.6cm，分離切口兩側表皮暴露顱骨。參考腦立體定位圖譜中紋狀體位置，沿前囟前1.0mm、右側2.0mm，顱骨鉆打孔，孔徑約1mm，無菌生理鹽水沖洗鉆孔處。10μl平頭微量注射器手動吸取細胞懸液，再用腦立體定位儀結合微量注射器注射5μl細胞懸液（2×10⁵個細胞，若調整細胞接種量，則優先調整細胞懸液濃度），首次進針深度3.5mm，退針0.5mm，勻速注射，注射時間約10min。注射完成后停針5min，緩慢拔針，骨孔立即用骨蠟封填，縫合切口并使用碘伏消毒。手術結束后，肌內注射5萬U青霉素預防術后感染。

1.4.3" 動物觀察及腫瘤生長監測" 每日定時觀察動物活動狀態，監測動物體質量變化并及時記錄。腫瘤生長通過活體成像技術進行監測。活體成像：稱取一定量D-螢光素鉀鹽粉末，用無菌生理鹽水溶解，配制成15mg/ml D-螢光素鉀鹽溶液（溶液經0.22μm濾膜過濾除菌）并避光保存。腹腔注射200μl D-螢光素鉀鹽溶液，注射10min后異氟烷麻醉小鼠并利用小鼠活體成像系統進行化學發光檢測。

1.5" 動物分組及給藥

細胞接種量摸索實驗中，裸鼠隨機分為兩組，每組3只。兩組的細胞接種量分別為1×10⁵個/只和2×10⁵個/只。替莫唑胺藥效試驗中，將造模后的裸鼠隨機分為對照組和替莫唑胺組，每組9只。替莫唑胺組裸鼠每周腹腔注射替莫唑胺1次，給藥劑量3mg/kg，共持續2周；對照組裸鼠每周腹腔注射生理鹽水1次，共持續2周。

1.6" 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（"）表示，比較采用方差分析或t檢驗。生存期分析采用Log-rank檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" U87MG-Luc細胞成功構建

利用螢光素酶報告系統的生物發光成像是一種可用于體內跟蹤并可視化標記細胞群的技術^[8-9]。通常檢測標記細胞隨時間在特定位置的存在，可揭示在發育、疾病或治療過程中細胞增殖或存活的變化情況^[8，10]。實驗結果顯示，U87MG-Luc細胞相較于U87MG細胞可代謝底物螢光素并發出熒光，說明U87MG-Luc可順利表達螢光素酶，見圖1A。通過對不同代數U87MG-Luc細胞進行生物發光及蛋白表達檢測發現，U87MG-Luc直至傳代20次仍可穩定表達螢光素酶，見圖1B、C、D。為驗證細胞數量與熒光信號間的線性關系，對不同細胞量進行熒光檢測，發現在2500～21 250個細胞范圍內，熒光信號與細胞數量間的線性關系良好，見圖1E、F。說明U87MG-Luc構建成功，可用于體內模型構建。

2.2" 裸鼠膠質母細胞瘤原位移植瘤模型建立

利用U87MG-Luc細胞建立裸鼠原位移植瘤模型。經過對細胞接種量探索發現，當細胞接種量為1×10⁵個/只，術后動物腫瘤信號隨時間變弱，體內成瘤效果差；而當細胞接種量為2×10⁵個/只時，術后9d動物腫瘤信號均一且穩定，信號僅集中在腦部，未見明顯轉移，見圖2。故后續建立模型時，細胞接種量設置為2×10⁵個/只。

為驗證該模型預測效度，利用替莫唑胺進行藥效試驗。對照組裸鼠腫瘤逐漸增長，且腫瘤生長速度適宜，體質量未見明顯變化。生存期監測發現該模型動物術后25d（對照組）開始出現死亡/瀕死，說明該模型有相對足夠的病程時間。替莫唑胺因其較好的治療效果現為膠質母細胞瘤臨床治療的一線用藥，且常作為臨床前研究的陽性工具藥^[11]。與對照組相比，替莫唑胺組裸鼠腫瘤生長受到顯著抑制，且生存期顯著延長（Plt;0.001）。給藥期間兩組裸鼠的體質量均未見明顯變化，見圖3。

3" 討論

膠質母細胞瘤是一種常見的顱內惡性腫瘤，目前臨床仍缺乏有效的治療藥物^[12]。近年來，已投入大量精力進行膠質母細胞瘤的機制研究及新藥開 發^[13]。在新藥開發臨床前研究階段，選擇合適的動物模型至關重要。比較理想的膠質母細胞瘤模型通常需要概括影響生存和治療反應的人膠質母細胞瘤的關鍵特征，包括浸潤性的組織學特征、腫瘤代謝、免疫微環境和遺傳譜，且模型對現有治療（放療或藥物治療）的反應也應類似于人膠質母細胞瘤^[7，14-15]。本文主要介紹利用膠質母細胞瘤細胞系U87MG構建裸鼠腦原位移植瘤模型的方法，為后續該模型使用及研究提供可參考數據。

膠質母細胞瘤小鼠模型大致分為三種：同源小鼠模型、基因工程小鼠模型、異種移植模型。其中，異種細胞系移植模型因模型構建較為便捷，且能很好地模擬人膠質母細胞瘤組織病理學，被廣泛應用于各類臨床前研究中。U87MG細胞系是文獻中使用最廣泛的人膠質母細胞瘤細胞系之一，且對替莫唑胺敏感^[6]。依據經驗，U87MG細胞相對較難轉染，常規脂質體轉染效率較低，故本研究通過慢病毒轉染構建U87MG螢光素酶報告體系實現細胞數量及生長的體內檢測，通過腦立體定位方法將U87MG-Luc細胞注射入裸鼠腦內，建立穩定的動物模型。為驗證該模型具有一定預測效度，利用替莫唑胺進行驗證，最終確定該模型構建成功。

但該模型仍存在一定不足。如研究發現螢光素酶表達細胞植入可導致該細胞在動物體內生長速度及轉移發生變化^[16-17]。U87MG細胞轉染螢光素酶基因后，可能在抗生素篩選過程中，篩選出的單克隆細胞與原始U87MG細胞存在表型差異。為避免這一情況，需進一步研究U87MG-Luc與U87MG細胞基因表達譜差異，并檢測兩種細胞增殖、侵襲、遷移能力及對各類陽性治療藥物的反應。有文獻報道與人膠質母細胞瘤相比，植入小鼠的U87MG腫瘤界限清晰，周圍有反應性星形膠質細胞，無彌漫性浸潤^[18-19]；與人膠質母細胞瘤相比，U87MG腫瘤的血管系統通透性更高，這可能增加藥物進入腫瘤微環境^[19]。因此在該模型應用過程中需注意這些潛在風險，且仍需繼續研究以建立更加合適的動物模型。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–12）

（修回日期：2025–08–04）