唐山市某牛場奶牛球蟲的分離與鑒定

牛球蟲病是由于牛感染了艾美耳球蟲而引發(fā)的以腹瀉為臨床癥狀的牛腸道原蟲疾病。犢牛最易受到感染，因此牛球蟲病也是幼齡奶牛腹瀉的病因之一。艾美耳球蟲屬于直接發(fā)育型，其卵囊形態(tài)為橢圓或近似于圓形，卵壁光滑。球蟲直接發(fā)育不需要借助中間的宿主來發(fā)育生長。在我國已發(fā)現(xiàn)牛球蟲病原有16種，其中牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲的致病力最強，是引起牛球蟲病的主要病原[1]。球蟲病的傳播多為攜帶球蟲的奶牛排出的糞便中含有艾美耳球蟲，糞便污染養(yǎng)殖場奶牛圈舍的環(huán)境以及飲水和飼料，再被其他奶牛通過口食飼料或飲水進入體內(nèi)[2]。球蟲病的傳播也與外界的氣溫氣候濕度條件有很大的關系，具有典型的季節(jié)性特征[3]。在氣候溫暖多雨的春夏秋三個季節(jié)最易暴發(fā)，特別是在多雨的季節(jié)[4。基于疾病的發(fā)展速度和臨床表現(xiàn)，牛球蟲病可被分為兩大類型：急性型和慢性型[5]。急性型病癥通常在10～15d內(nèi)顯現(xiàn)，初期病牛會表現(xiàn)出抑郁、毛發(fā)比較松亂、體溫略微有升高的情況。1周后病情開始加重，奶牛呈現(xiàn)出明顯的無精打采、體重肉眼可見的下降，并且體溫會升至40℃左右。奶牛胃腸的蠕動可能會暫停，排泄物會變成帶有血的稀便并伴有惡臭，在疾病晚期，糞便呈現(xiàn)黑色，糞便中帶血液，最終奶牛因嚴重的貧血導致死亡[。相比之下，慢性型的牛在發(fā)病3～5d后會有所改善，但持續(xù)的腹瀉依然存在，并持續(xù)伴有貧血癥狀，這個情況可能會持續(xù)數(shù)月，最終奶牛會因為嚴重的貧血消瘦而死亡[]。牛球蟲病已經(jīng)嚴重危害動物健康，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[

為了解唐山市某奶牛養(yǎng)殖場球蟲感染情況，本研究采用飽和食鹽水漂浮法、形態(tài)觀察法分離并鑒定該牛場的球蟲種類。本研究結(jié)果為該牛場球蟲病的治療提供科學依據(jù)，制定有效的防控措施，以減少該病的傳播，降低經(jīng)濟損失，保障其健康穩(wěn)定發(fā)展。

1材料

1.1試驗樣品

2024年11月一2025年3月采集唐山市某奶牛場腹瀉牛新鮮糞便，共計50份樣品。將采集樣品置于樣品保存袋中，每一份樣品需標注采集地點、采集時間、動物種類、動物年齡、糞便性狀等詳細資料。每一份樣品稱重 100g ，置于 4^°C 冰箱內(nèi)保存。

1.2主要試劑和儀器

NaC1購自天津市北辰方正試劑廠；重鉻酸鉀購自河南揚子化工有限公司；60目銅絲篩購自上海豐行篩網(wǎng)制造有限公司；雙目生物顯微鏡購自上光儀器有限公司；臺式離心機購自常州國華電器有限公司。

1.3主要溶液的配制

飽和食鹽水溶液：在燒杯中稱取400g食鹽，隨后向燒杯內(nèi)加入 1000mL 蒸餾水，將燒杯置于熱源上加熱，不斷攪拌直至食鹽完全溶解，等待其自然冷卻至室溫，若在冷卻過程中觀察到少量食鹽析出，即為飽和食鹽水。

2.5% 重鉻溶液：在燒杯中稱取25g重鉻酸鉀固體，隨后向燒杯中加入預先煮沸的蒸餾水至 1000mL 刻度線處，充分攪拌，確保重鉻酸鉀完全溶解，制備完成后，將其置于室溫下保存，即為 2.5% 重鉻酸鉀溶液。

2方法

2.1球蟲卵囊的收集

本研究利用飽和食鹽水漂浮法收集奶牛球蟲卵囊：將采集的奶牛新鮮糞便樣品加入2倍體積的自來水，混勻后使用60目銅絲篩對混合液進行過濾，收集含有球蟲卵囊的濾液濾渣。對濾渣重復三次相同操作，棄去濾渣收集濾液。濾液靜置3h棄去上清液后充分攪拌，形成混懸液，經(jīng)過3 500r/min 離心5min ，棄上清液，保留沉淀。向沉淀中加入適量飽和食鹽水，形成混懸液，離心保留上清液，棄去沉淀。將含有卵囊的上清液加入3倍體積的自來水混合后離心收集沉淀，所得沉淀即為球蟲卵囊。

2.2球蟲卵囊的孢子化培養(yǎng)

將分離得到的球蟲卵囊沉淀轉(zhuǎn)移至干凈的平Ⅲ（深度不超過 1cm ）中，進行球蟲卵囊的孢子化培養(yǎng)，向含有球蟲卵囊沉淀物的平血內(nèi)加入 2.5% 重鉻酸鉀溶液，為確保孢子化過程順利進行，平血須保持敞口狀態(tài)，以維持氣體交換。將平血放入設定為28^°C 的恒溫培養(yǎng)箱中，保持通氣狀態(tài)，為球蟲卵囊孢子化培養(yǎng)提供最優(yōu)的環(huán)境條件。在培養(yǎng)孢子化球蟲卵囊期間，無法避免平血內(nèi)重鉻酸鉀溶液中的水分被蒸發(fā)，因此需要定期向平血中添加28 C 的蒸餾水，以保證培養(yǎng)溶液高度始終在合適的范圍內(nèi)。在孢子化培養(yǎng)24h后，需要每12小時對孢子化培養(yǎng)的卵囊進行檢查，以監(jiān)測其生長和孢子化情況。經(jīng)過2～3d，當觀察到 80% 以上的球蟲卵囊完成孢子化后，從培養(yǎng)箱中取出，置于 4^°C 的冰箱中保存，待檢。

2.3球蟲蟲種的鑒定

通過制片觀察，在400倍顯微鏡下，隨機對40個未孢子化卵囊進行鏡檢。觀察所得的卵囊照片中卵囊的大小、形態(tài)以及結(jié)構(gòu)特征，并對這些特征進行了詳細地記錄。隨機檢測40個孢子化卵囊，記錄其中孢子囊的形態(tài)大小，完成孢子化所需的時間等數(shù)據(jù)，為后續(xù)的分析提供重要的依據(jù)。將所有測量數(shù)據(jù)進行匯總，并參照相關文獻的數(shù)據(jù)進行比對，對奶牛球蟲蟲種進行鑒定。

3結(jié)果與分析

3.1球蟲卵囊分離鑒定結(jié)果

如圖1所示，可觀察到其特征，卵囊呈橢圓形，卵囊壁分為內(nèi)外兩層，呈黃綠色，大小為 22.10μm×15.30μm_o 卵囊內(nèi)含有四個孢子囊，每一個孢子囊中含有兩個子孢子，卵囊尖端處有卵膜孔。如圖2所示，可觀察未孢子化卵囊特征，卵囊呈橢圓形，其卵囊壁結(jié)構(gòu)分明，分為內(nèi)外兩層，卵囊壁整體呈深黃色，內(nèi)壁為淡褐色，箭頭所示為球蟲未孢子化卵囊。詳見圖1-2。

3.2球蟲種類的鑒定

隨機測量40個未孢子化卵囊和40個已孢子化卵囊中的孢子囊的大小，數(shù)據(jù)見表1。

與所查閱的資料和文獻中未孢子化卵囊和已孢子化卵囊的孢子囊大小的數(shù)據(jù)比較，本研究測得的數(shù)據(jù)在資料范圍內(nèi)，結(jié)果見表2。研究結(jié)果表明，分離出的球蟲是牛艾美耳球蟲。

4討論

本研究采用飽和食鹽水漂浮法進行球蟲卵囊的分離，此方法操作簡便、成功率高，但在實驗過程中需注意傾倒上清液、轉(zhuǎn)移混懸液等步驟，要嚴格遵守實驗操作流程，防止球蟲卵囊丟失；離心后應仔細檢查離心管內(nèi)的液面，防止由于轉(zhuǎn)數(shù)不足或離心時間不夠?qū)е孪x體沒有完全存在于某一液層中造成卵囊的丟失。雖然有研究認為，飽和食鹽水漂浮法的處理對卵囊的活力無顯著性影響[14]。但是由于未孢子化的球蟲卵囊相較于孢子化的球蟲卵囊對外界環(huán)境的刺激更加敏感，龔振興等[15研究發(fā)現(xiàn)當采用飽和食鹽水對未孢子化的球蟲卵囊進行處理過程中，若處理時間過長，會對未孢子化卵囊造成一定程度的損傷，這種損傷會對后續(xù)的孢子化發(fā)育過程產(chǎn)生不利影響。由此可知，接觸的時間增加，可能將導致卵囊的孢子化率下降。因此在利用飽和食鹽水漂浮法收集球蟲卵囊時需注意，應嚴格限制飽和食鹽水與球蟲卵囊的接觸時間，確保接觸時間控制在 30min 內(nèi)。

表1卵囊和孢子囊大小測量數(shù)據(jù)

表2測量結(jié)果匯總

圖1孢子化的球蟲卵囊

卵囊大小是球蟲種類鑒定的重要指標，為使測量數(shù)據(jù)具有代表性，本研究隨機選取40個未孢子化卵囊和40個孢子化卵囊的孢子囊，根據(jù)其大小、形態(tài)等方面進行判斷。利用飽和食鹽水漂浮法分離得到的球蟲卵囊，在生物顯微鏡下直接鏡檢，形態(tài)學觀察本研究獲得的牛艾美耳球蟲卵囊為橢圓形，卵囊壁分為內(nèi)外兩層，呈黃綠色，卵囊大小范圍為（ 21.10～28.50 ） μm×（15.00～20.60） μm ，與曹希亮等[1]、張曉東等[1]、張龍現(xiàn)等[12]、趙其平等[12]報道的牛艾美耳球蟲卵囊形態(tài)特征相似。已孢子化卵囊中的孢子囊大小范圍為（ 12.20～17.50 ） μm× 0 5.10～7.60 ） μm ，與張龍現(xiàn)等12報道的孢子囊大小數(shù)值范圍相符。

結(jié)語

本研究通過對唐山市某牛場奶牛球蟲的分離與鑒定，明確了該牛場奶牛球蟲的感染種類、形態(tài)特征及感染情況，為牛場球蟲病的防控提供了基礎數(shù)據(jù)支撐。研究過程中，采用飽和鹽水漂浮法和顯微鏡檢查等技術，成功分離出目標球蟲卵囊。從研究結(jié)果來看，該牛場存在一定程度的奶牛球蟲感染，提示球蟲病可能是影響奶牛健康和生產(chǎn)性能的潛在因素之一。這一發(fā)現(xiàn)為牛場制定針對性防控措施提供了科學依據(jù)，可有效降低球蟲感染風險，保障奶牛養(yǎng)殖效益。

圖2未孢子化的球蟲卵囊和孢子化的球蟲卵囊

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收稿日期：2025-06-23

作者簡介：王小月（1995一），女，漢族，碩士，獸醫(yī)師。研究方向：動物疫病診斷與防控。*通訊作者：董李學（1984—），男，漢族，碩士，研究員。研究方向：動物疫病診斷與防控。