口蹄疫病毒弱毒株遺傳穩(wěn)定性構(gòu)建

口蹄疫（Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD）是全球畜牧業(yè)面臨的重大威脅，由FMDV引發(fā)，該病毒屬于小RNA病毒科下的口蹄疫病毒屬，具有高度傳染性和變異能力。FMDV存在7個(gè)血清型和眾多亞型，各型之間缺乏交叉保護(hù)，一旦暴發(fā)，不僅對(duì)動(dòng)物健康造成嚴(yán)重影響，還會(huì)對(duì)國(guó)家的畜牧業(yè)生產(chǎn)、國(guó)際貿(mào)易和外交關(guān)系產(chǎn)生重大負(fù)面影響。因此，世界各國(guó)都非常重視對(duì)口蹄疫的預(yù)防和控制1]

在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，傳統(tǒng)的滅活疫苗雖是預(yù)防口蹄疫的主要手段，但存在在多次免疫后仍能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的問(wèn)題，這樣會(huì)給疫病的血清學(xué)監(jiān)控和流行病學(xué)調(diào)查帶來(lái)挑戰(zhàn)。

1口蹄疫病毒生物學(xué)特性與遺傳變異

1.1口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)與生命周期

口蹄疫病毒（FMDV）的結(jié)構(gòu)與生命周期是其生物學(xué)特性的重要組成部分，對(duì)病毒的傳播、致病性和疫苗設(shè)計(jì)具有深遠(yuǎn)影響。FMDV為單股正鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)約 8.4kb ，編碼一個(gè)多聚蛋白前體，把病毒自身的蛋白酶作用裂解為多個(gè)結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白（如圖1，F(xiàn)MDV基因組RNA基本結(jié)構(gòu)）。病毒顆粒呈二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑約為 22～30nm ，由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中VP1、VP2和VP3位于病毒表面，參與病毒的吸附和入侵過(guò)程，而VP4則位于病毒衣殼的內(nèi)部。FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白包括2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，其中3D為RNA依賴(lài)的RNA聚合酶，是病毒復(fù)制的核心酶，詳見(jiàn)圖1。

病毒基因組非編碼區(qū)含有內(nèi)部核糖體進(jìn)人位點(diǎn)（IRES），負(fù)責(zé)調(diào)控病毒蛋白的翻譯效率。結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1的G～H環(huán)區(qū)域是重要的抗原決定簇，同時(shí)也是毒力相關(guān)位點(diǎn)。已有研究通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)搮^(qū)域的精氨酸一甘氨酸—天冬氨酸（RGD）基序，成功獲得了毒力降低但仍保持良好免疫原性的弱毒株。VP2和VP3蛋白則主要參與病毒衣殼的組裝，其穩(wěn)定性突變可顯著提升病毒顆粒的熱穩(wěn)定性，這對(duì)疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸具有重要意義。

圖1FMDV基因組RNA基本結(jié)構(gòu)

非結(jié)構(gòu)蛋白如2C、3A等在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中3A蛋白的長(zhǎng)度多態(tài)性與病毒宿主范圍密切相關(guān)，通過(guò)縮短該蛋白的編碼序列可獲得宿主適應(yīng)性受限的弱毒株。這種基于基因組功能區(qū)域系統(tǒng)改造的策略，確保了弱毒株的核心抗原性，還通過(guò)多重遺傳屏障有效防止了毒力增強(qiáng)現(xiàn)象的發(fā)生。

FMDV的生命周期包括吸附、侵入、脫殼、復(fù)制、裝配和釋放等階段。病毒顆粒通過(guò)與宿主細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合進(jìn)行吸附，因內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞體中，病毒顆粒脫殼釋放RNA基因組。病毒的RNA基因組在細(xì)胞質(zhì)中作為模板，通過(guò)3D聚合酶的催化作用進(jìn)行復(fù)制，在病毒蛋白酶的作用下，多聚蛋白前體被裂解為結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。結(jié)構(gòu)蛋白在病毒裝配過(guò)程中自我組裝成新的病毒顆粒，非結(jié)構(gòu)蛋白則參與病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)和干擾宿主細(xì)胞的抗病毒機(jī)制。新組裝的病毒顆粒通過(guò)細(xì)胞膜的出芽或細(xì)胞裂解的方式進(jìn)行釋放，開(kāi)始新一輪的感染循環(huán)。

FMDV的生命周期中，病毒基因組的復(fù)制和蛋白的翻譯過(guò)程高度依賴(lài)于宿主細(xì)胞的機(jī)制，病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的活性對(duì)病毒的復(fù)制效率和遺傳穩(wěn)定性具有重要影響。例如，非結(jié)構(gòu)蛋白3C蛋白酶在病毒多聚蛋白前體的裂解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而3D聚合酶的保真性則直接影響病毒復(fù)制過(guò)程中的變異率。

1.2病毒遺傳變異機(jī)制與弱毒株篩選

FMDV的遺傳變異機(jī)制主要涉及病毒復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤傾向和宿主免疫壓力下的適應(yīng)性進(jìn)化。病毒RNA聚合酶3D在復(fù)制病毒基因組時(shí)，缺乏校正功能，這導(dǎo)致了較高的突變率，為病毒提供快速適應(yīng)環(huán)境變化的能力[3。在宿主體內(nèi)，F(xiàn)MDV面臨強(qiáng)烈的免疫選擇壓力，促使病毒不斷變異以逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別與清除。

構(gòu)建弱毒株時(shí)，篩選具有遺傳穩(wěn)定性和安全性的候選株是關(guān)鍵步驟。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化和反向遺傳學(xué)技術(shù)，引入特定的突變或缺失，以削弱病毒的致病性而不影響其免疫原性。刪除或突變非結(jié)構(gòu)蛋白中的免疫優(yōu)勢(shì)表位，發(fā)展出能激發(fā)有效免疫反應(yīng)，不會(huì)在宿主體內(nèi)產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的標(biāo)記疫苗。引入提前終止密碼子（PrematureTerminationCodon，PTC）和應(yīng)用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)，構(gòu)建攜帶琥珀終止密碼子的重組口蹄疫病毒（PTC-FMDV），提高弱毒株的遺傳穩(wěn)定性，降低毒力恢復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)。

弱毒株篩選按照以下步驟進(jìn)行：第一步，基于理論分析和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一系列攜帶不同突變的弱毒株候選株；第二步，通過(guò)在細(xì)胞系中的連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)評(píng)估其遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)特性、抗原性、毒力水平和安全性；第三步，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證弱毒株的安全性和有效性，確保其在宿主體內(nèi)不會(huì)引起疾病，激發(fā)充分的免疫反應(yīng)。郭慧琛團(tuán)隊(duì)闡明完整口蹄疫病毒抗原高效保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，如圖2。

圖2口蹄疫病毒抗原高效保護(hù)作用結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

2弱毒株遺傳穩(wěn)定性構(gòu)建策略

2.1基因工程方法在弱毒株構(gòu)建中的應(yīng)用

在構(gòu)建口蹄疫病毒弱毒株的過(guò)程中基因工程方法起到了關(guān)鍵作用，使得弱毒株的安全性以及遺傳穩(wěn)定性均得到了提升。舉例來(lái)說(shuō)運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)病毒的RNA基因組加以改造，引入特定的突變或者缺失，以此改變病毒的生物學(xué)特性，這項(xiàng)技術(shù)可精準(zhǔn)控制病毒基因組里的關(guān)鍵區(qū)域，像是非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)表位[4。借助將這些表位給予刪除或者突變，研發(fā)出了可激發(fā)有效免疫反應(yīng)且不會(huì)在宿主體內(nèi)產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的標(biāo)記疫苗，借助基因編輯技術(shù)精確編輯病毒基因組，敲除或者插入特定的遺傳信息，削弱病毒的致病性同時(shí)不影響其免疫原性，CRISPR—Cas9所有的高效性以及特異性讓弱毒株的構(gòu)建變得更加精確且可控。

融合PCR與RT-PCR技術(shù)，構(gòu)建出含有特定氨基酸缺失的全長(zhǎng)重組質(zhì)粒，借助精心設(shè)計(jì)的引物，研究人員可準(zhǔn)確地在病毒基因組中引入缺失或者突變，如圖3所示，針對(duì)口蹄疫病毒抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，優(yōu)化弱毒株的遺傳特性，結(jié)合RT-PCR技術(shù)對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒開(kāi)展序列測(cè)定，驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性，保證構(gòu)建的弱毒株符合預(yù)期設(shè)計(jì)，擁有良好的遺傳穩(wěn)定性。還可采用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)，憑借在病毒基因組中引入提前終止密碼子，并且利用正交翻譯元件解碼這些密碼子，構(gòu)建攜帶琥珀終止密碼子的重組口蹄疫病毒，這項(xiàng)技術(shù)提升了弱毒株的遺傳穩(wěn)定性，為研究FMDV的生物學(xué)特性提供了全新的工具，比如探討非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制、感染性以及免疫反應(yīng)中的作用

圖3口蹄疫病毒抗原結(jié)構(gòu)解析

在構(gòu)建弱毒株的過(guò)程中，生物信息學(xué)分析與預(yù)測(cè)所發(fā)揮的作用不容小，研究人員借助對(duì)病毒基因組序列展開(kāi)分析，并對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能加以預(yù)測(cè)，以此可更為精準(zhǔn)地挑選突變位點(diǎn)。對(duì)弱毒株的設(shè)計(jì)給予優(yōu)化，借助像序列比對(duì)以及變異分析軟件這類(lèi)生物信息學(xué)工具，可幫助實(shí)驗(yàn)人員對(duì)弱毒株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，保證其在連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)里的表現(xiàn)契合預(yù)期。

2.2遺傳穩(wěn)定性評(píng)估與優(yōu)化

在弱毒株開(kāi)發(fā)進(jìn)程中，遺傳穩(wěn)定性評(píng)估屬于關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其作用是保障疫苗株于生產(chǎn)、存儲(chǔ)以及應(yīng)用階段的遺傳一致性，避免毒力恢復(fù)與變異情況發(fā)生。評(píng)估方法有連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及生物信息學(xué)分析等，借助構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與變異網(wǎng)絡(luò)，對(duì)弱毒株的遺傳進(jìn)化及穩(wěn)定性給予評(píng)估。依據(jù)這些評(píng)估方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳穩(wěn)定性的優(yōu)化，像非結(jié)構(gòu)蛋白優(yōu)化、運(yùn)用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)以及優(yōu)化基因編輯技術(shù)，借助這些方法，可精確評(píng)估并優(yōu)化弱毒株的遺傳穩(wěn)定性，保證其作為疫苗株時(shí)的安全性與有效性。

評(píng)估弱毒株遺傳穩(wěn)定性需采用體外與體內(nèi)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)體系，通過(guò)多維度指標(biāo)驗(yàn)證改造毒株在傳代過(guò)程中的性狀保持能力。體外評(píng)估主要依托細(xì)胞模型開(kāi)展連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)，這是驗(yàn)證基因組穩(wěn)定性的基礎(chǔ)方法。將重組弱毒株接種于BHK-21細(xì)胞，每隔48h收集病毒液進(jìn)行傳代，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增VP1等關(guān)鍵基因片段并測(cè)序，比對(duì)各代次間目標(biāo)區(qū)域的序列一致性。數(shù)據(jù)顯示[7]，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后，改造毒株的VP1基因G～H環(huán)區(qū)域未出現(xiàn)顯著突變，證實(shí)定向修飾的位點(diǎn)具有良好穩(wěn)定性。

體內(nèi)評(píng)估則通過(guò)易感動(dòng)物模型驗(yàn)證弱毒株的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性。選用3～5日齡乳鼠進(jìn)行連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)[8，每代接種后觀察臨床癥狀并測(cè)定病毒載量。與野生毒株相比，改造弱毒株在各代次中均未引起典型足部水皰病變，病理組織學(xué)檢查顯示其致病性維持在穩(wěn)定水平。

2.3弱毒株遺傳穩(wěn)定性影響因素分析

弱毒株的遺傳穩(wěn)定性會(huì)受到諸多因素的影響，這些因素涉及了病毒基因組本身所有的自然變異傾向、特定非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域呈現(xiàn)出的特性，以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和宿主體內(nèi)環(huán)境所產(chǎn)生的作用，病毒基因組存在變異傾向，口蹄疫病毒的RNA基因組由于其RNA依賴(lài)的RNA聚合酶缺乏校正功能，有較高的自然變異率這種變異傾向來(lái)源于復(fù)制過(guò)程中存在的錯(cuò)誤傾向，并且受到宿主免疫系統(tǒng)選擇壓力的作用，在構(gòu)建弱毒株時(shí)，要考慮其基因組的自然變異傾向，借助反向遺傳學(xué)技術(shù)以及基因編輯技術(shù)，減少或者控制這些變異位點(diǎn)，以此來(lái)提高弱毒株的遺傳穩(wěn)定性。

非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域有特定特性，非結(jié)構(gòu)蛋白當(dāng)中的特定區(qū)域，比如3A蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)表位，對(duì)弱毒株的遺傳穩(wěn)定性有著關(guān)鍵影響。該區(qū)域發(fā)生變異會(huì)致使病毒出現(xiàn)遺傳漂變，影響弱毒株的安全性與有效性，依靠精心設(shè)計(jì)的突變或者缺失，減弱該區(qū)域的變異傾向，提高弱毒株的遺傳穩(wěn)定性，利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)，構(gòu)建攜帶琥珀種質(zhì)密碼子的重組口蹄疫病毒，可有效控制非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的變異，提高弱毒株的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

在宿主體內(nèi)，病毒面臨的免疫壓力以及變異選擇機(jī)制會(huì)致使弱毒株發(fā)生變異，借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以評(píng)估弱毒株在真實(shí)免疫環(huán)境中的遺傳穩(wěn)定性，先進(jìn)技術(shù)得到應(yīng)用與優(yōu)化，基因編輯技術(shù)以及生物信息學(xué)分析在弱毒株遺傳穩(wěn)定性評(píng)估和優(yōu)化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，CRISPR一Cas9等基因編輯工具可精確修改病毒基因組中的關(guān)鍵位點(diǎn)，減少非預(yù)期變異，提高弱毒株的遺傳穩(wěn)定性。生物信息學(xué)工具，像序列比對(duì)和變異分析軟件，可使研究人員在分子水平上理解弱毒株的變異模式，為遺傳穩(wěn)定性?xún)?yōu)化提供科學(xué)依據(jù)[8]

結(jié)語(yǔ)

本文成功構(gòu)建出一系列有遺傳穩(wěn)定特性且安全有效的口蹄疫弱毒株疫苗候選株，這些弱毒株于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)出了相當(dāng)出色的遺傳穩(wěn)定性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)里也證實(shí)了它們的安全性以及免疫原性，這為口蹄疫疫苗的研發(fā)提供了全新的策略與方法。未來(lái)若能優(yōu)化弱毒株的構(gòu)建策略，提升疫苗的免疫效果，借助持續(xù)不斷的科技創(chuàng)新以及國(guó)際合作，有望在全球范圍內(nèi)控制口蹄疫疫情，保障畜牧業(yè)的健康及可持續(xù)發(fā)展。

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收稿日期：2025-05-23

作者簡(jiǎn)介：王賽措（1985—），女，藏族，碩士，工程師。研究方向：獸醫(yī)疫苗。*通訊作者：馬志鵬（1978—），男，東鄉(xiāng)族，本科，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：獸用生物制品質(zhì)量評(píng)價(jià)。