免疫組織化學(xué)實驗關(guān)鍵影響因素解析及優(yōu)化對策

免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)在病理診斷與基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛，其結(jié)果可靠性依賴于全流程質(zhì)量控制。實驗流程涵蓋取材固定、脫水透明、切片、抗原修復(fù)、抗體孵育及顯色觀察等步驟，各環(huán)節(jié)的操作規(guī)范直接影響實驗成功率。近5年研究顯示，約 42% 實驗偏差源于前處理不當(dāng)[1。本文根據(jù)作者多年的經(jīng)驗并結(jié)合2019—2024年最新文獻與技術(shù)規(guī)范，詳細解析各個步驟中的關(guān)鍵影響因素并提出有效的優(yōu)化策略。

1取材與固定

取材是實驗的第一步，其質(zhì)量直接影響到后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性。取材的關(guān)鍵在于組織的新鮮程度、大小、固定方式及固定時間。

1.1組織新鮮程度

組織離體后，細胞會迅速發(fā)生自溶和腐敗，導(dǎo)致抗原降解或擴散，影響抗原的保存和檢測。組織離體后需在 30min 內(nèi)浸入足量固定液。離體后2h內(nèi)未及時固定易導(dǎo)致抗原降解或彌散，HE染色出現(xiàn)細胞核灰染，免疫組化信號減弱甚至丟失[2]。

1.2組織大小

組織塊過大，固定液難以滲透，導(dǎo)致中心部位固定不良；組織塊過小則可能不足以進行多次切片或檢測。一般建議組織塊大小為1 cm×1cm×0.3cm 左右，組織塊不要超過 1.5cm×1.5cm×0.5cm^[2] 。

1.3固定方式

固定方法不當(dāng)會導(dǎo)致抗原丟失或結(jié)構(gòu)破壞。對于不同的組織和抗原，應(yīng)選擇合適的固定方法，如靈長類肝組織采用灌注固定聯(lián)合浸入固定，較單一方法抗原保存率提升 25%

1.4固定時間

過度固定（ gt;48h ）會因醛基交聯(lián)導(dǎo)致抗原表位遮蔽，固定不足則引起組織自溶和抗原彌散，固定時間在12～48h為宜，具體時間應(yīng)根據(jù)組織類型和固定液種類確定。

1.5固定液

IHC固定液推薦 10% 中性緩沖福爾馬林，pH值為7.2～7.4 ，能較好地保存組織形態(tài)和抗原性，固定時間需嚴格控制，固定液體積需為組織體積4～10倍，確保充分滲透。

2 脫水、透明和浸蠟[3]

脫水是免疫組化實驗中的重要步驟，脫水不徹底會影響后續(xù)透明和浸蠟效果，導(dǎo)致切片質(zhì)量下降。常用的脫水劑為乙醇，其濃度、脫水時間及溫度是影響脫水效果的關(guān)鍵因素。

2.1脫水溫度

脫水溫度過高會導(dǎo)致組織快速收縮，影響組織結(jié)構(gòu)的完整性。脫水溫度過低則可能導(dǎo)致脫水不徹底，脫水溫度一般控制在室溫或略高于室溫，避免高溫導(dǎo)致的組織快速收縮。

2.2乙醇濃度及脫水時間

脫水時間過短會導(dǎo)致脫水不徹底，影響組織的透明度和切片質(zhì)量；脫水時間過長則可能引起組織過度收縮，影響組織結(jié)構(gòu)。需遵循梯度酒精脫水（ 70%～10% ），每級停留時間依組織類型調(diào)整（如肝、腎組織 30min 級，淋巴組織，確保水分完全置換。

2.3脫水劑

不同的脫水劑對組織的收縮作用不同，應(yīng)根據(jù)組織類型和目標(biāo)抗原的特性選擇合適的脫水劑，對于大多數(shù)組織，乙醇是常用的脫水劑。

2.4透明及浸蠟

二甲苯透明時間過長會導(dǎo)致組織硬化發(fā)脆，推薦時間為 1～2h ；浸蠟選擇 56～58^°C 低熔點石蠟，浸蠟3次共 2～3h ，避免高溫（ gt;65°C ）破壞抗原結(jié)構(gòu)。

3切片制備

切片是免疫組化實驗中的關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量直接影響到抗原檢測的準確性和可靠性。切片不當(dāng)會導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞、抗原丟失或分布不均。切片的厚度、刀片的質(zhì)量以及切片機的性能都會影響切片的質(zhì)量。

3.1切片厚度

切片過厚會導(dǎo)致抗原分布不均，會影響抗原的暴露和抗體的穿透，導(dǎo)致背景加深；切片過薄，則容易破碎，不利于操作和觀察，可能導(dǎo)致抗原信號減弱。常規(guī)石蠟切片 3～5μm ，淋巴結(jié)、腎等致密組織 2～4μm 腦等疏松組織 6～8μm ，冰凍切片 10～15μm （2號

3.2切片速度

切片速度過快會導(dǎo)致組織拉伸或斷裂，影響組織結(jié)構(gòu)的完整性；切片速度過慢則可能導(dǎo)致組織受熱，影響抗原的保存。根據(jù)組織類型和切片厚度調(diào)整切片速度，確保切片平整、無拉伸或斷裂。

3.3切片刀角度

建議切片刀角度為 15～30^° 。組織皺褶和刀痕是切片制備中常見的問題。應(yīng)根據(jù)組織類型和切片需求調(diào)整切片刀角度，確保切片平整、均勻，在切片過程中保持組織的平整和穩(wěn)定。

4烤片與脫蠟

烤片需嚴格控制溫度和時間，高溫或長時間烘烤會加速抗原氧化。一般在60 °C 烤片 1～2h ，不超過 ³h ；脫蠟不完全會阻礙抗體與抗原的結(jié)合，造成染色弱或無著色。可采用梯度脫蠟法，先使用高濃度二甲苯，再逐步降低濃度。推薦二甲苯浸泡2次共20～30min ，確保蠟層完全去除。

5抗原修復(fù)

抗原修復(fù)的是通過物理或化學(xué)方法去除這種遮蔽，暴露抗原決定簇，提高抗原的檢出率和檢測的準確性。

5.1修復(fù)方法

高壓修復(fù)和微波修復(fù)是常用的方法。高壓修復(fù)（121 C ， 2～3min ）能更徹底地暴露抗原，但對組織形態(tài)有一定影響，適用于大多數(shù)抗體；微波修復(fù)相對溫和，對組織形態(tài)影響較小，但修復(fù)效果不如高壓修復(fù)，適用于對抗原修復(fù)要求不高的抗體[4。

5.2修復(fù)液

不同的修復(fù)液適用于不同的抗原。修復(fù)液的pH值會影響抗原修復(fù)效果，檸檬酸鹽緩沖液pH值為6.0，染色背景清晰，適合大多數(shù)抗體；EDTA緩沖液pH值為8.0～9.0，對部分抗原修復(fù)效果較強，但染色背景可能加深，易造成假陽性結(jié)果。不同抗原適宜pH值不同，如ER、PR抗原在pH值為 18.0～9.0 修復(fù)效果更佳，細胞表面抗原多適用pH值為 6.0 需根據(jù)抗體說明書優(yōu)化緩沖液，避免單一pH值導(dǎo)致部分抗原修復(fù)不足或過度。

5.3修復(fù)時間

修復(fù)時間過短會導(dǎo)致抗原修復(fù)不足，影響抗原的檢出率；修復(fù)時間過長則可能導(dǎo)致抗原過度修復(fù)，影響抗原的結(jié)構(gòu)和檢測的準確性。高壓修復(fù)時間控制在2～3min ；微波修復(fù)時間可根據(jù)功率適當(dāng)調(diào)整。

6抗體孵育

抗體孵育是免疫組化實驗的核心步驟，孵育不當(dāng)會導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，背景過高，影響檢測的特異性和靈敏度。抗體孵育的效果受到抗體濃度、孵育時間、孵育溫度以及封閉液的影響。

6.1抗體濃度

抗體濃度過高會導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加、背景過高，濃度過低則可能導(dǎo)致抗原檢出率降低，導(dǎo)致信號弱或假陰性，影響檢測的靈敏度。優(yōu)先選擇特異性強、親和力高的單克隆抗體，避免多克隆抗體非特異性結(jié)合，其次抗體稀釋需預(yù)實驗優(yōu)化濃度，推薦倍比稀釋法梯度測試，選擇陽性強、背景好、信噪比較高的濃度作為實驗濃度。

6.2孵育溫度與時間

孵育時間和溫度也會影響抗體與抗原的結(jié)合。孵育溫度過低，會降低抗體與抗原的結(jié)合效率；孵育溫度過高，則可能導(dǎo)致抗體變性5。孵育時間過短會導(dǎo)致抗體與抗原的結(jié)合不充分；孵育時間過長則可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，背景過高。推薦4 C 過夜或37 C1h ， 37°C 孵育1h適用于多數(shù)抗體， 4^°C 過夜孵育可增強低表達抗原信號

6.3封閉與洗滌

封閉液的選擇和封閉時間都會影響封閉效果。封閉液選擇與二抗同源的血清（如羊血清封閉鼠源抗體），濃度為 5%～10% ，室溫孵育 30min ，阻斷非特異性蛋白結(jié)合位點。洗滌時加人 0.05% Tween-20的PBS能有效清除殘留抗體，每次洗滌時間不少于 3min ，共3次。

7顯色

顯色是免疫組化實驗的最后一步，顯色不當(dāng)會導(dǎo)致信號弱、背景高或非特異性染色，影響檢測結(jié)果的準確性和可靠性。顯色的強度和時間是影響顯色效果的關(guān)鍵因素

7.1顯色劑

不同的顯色劑靈敏度不同，需要根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的顯色劑。常用的顯色劑包括DAB、TMB等。對于大多數(shù)免疫組化實驗，DAB是常用的顯色劑。DAB顯色需現(xiàn)配現(xiàn)用，顯微鏡下觀察顯色進程，棕黃色出現(xiàn)后立即終止，避免時間過長導(dǎo)致背景加深。

7.2顯色時間

顯色時間過短，會導(dǎo)致信號弱或無法觀察到；顯色時間過長則可能導(dǎo)致背景過高或非特異性染色，影響檢測的特異性。顯色時間對于DAB一般為 1～5min ，具體時間應(yīng)根據(jù)顯色劑種類和檢測需求確定。顯色后應(yīng)立即用流水沖洗或使用終止液終止反應(yīng)，以防止顯色過度。

7.3顯色溫度

顯色溫度會影響酶的活性，從而影響顯色反應(yīng)的速度。溫度過高會導(dǎo)致顯色反應(yīng)過快，難以控制顯色程度；溫度過低則可能導(dǎo)致顯色反應(yīng)緩慢，影響檢測的靈敏度。顯色溫度一般控制在室溫。

8討論

8.1實驗效果的多因素協(xié)同性與標(biāo)準化必要性

IHC實驗效果是多環(huán)節(jié)協(xié)同作用的結(jié)果。如取材固定不規(guī)范可導(dǎo)致后續(xù)抗原修復(fù)失效，抗體孵育條件不當(dāng)會掩蓋組織前處理的優(yōu)化效果。本文系統(tǒng)梳理了各環(huán)節(jié)關(guān)鍵因素，強調(diào)建立并遵循標(biāo)準化操作流程（SOP）的重要性。SOP應(yīng)涵蓋從取材固定到顯色封片的所有步驟，明確關(guān)鍵參數(shù)。引入自動化染色設(shè)備可有效減少人為操作誤差，提高實驗的一致性和重復(fù)性。加強抗體驗證和質(zhì)量管控是從源頭減少誤差的關(guān)鍵。

8.2常見異常染色現(xiàn)象解析

假陽性。常因內(nèi)源性過氧化物酶或生物素未充分阻斷、抗體非特異性結(jié)合、組織邊緣干燥、試劑污染、抗原修復(fù)過度導(dǎo)致抗原彌散等。為避免假陽性應(yīng)充分阻斷內(nèi)源性酶/生物素、優(yōu)化抗體濃度及封閉條件、確保組織全程濕潤、使用高特異性單克隆抗體并優(yōu)化抗原修復(fù)強度。

假陰性。常因抗原修復(fù)不充分、抗體濃度過低或孵育時間不足、一抗失活、組織固定過度或不當(dāng)、顯色時間過短或顯色劑失效等。根據(jù)抗體說明書和預(yù)實驗優(yōu)化抗原修復(fù)方法及參數(shù)、優(yōu)化抗體稀釋度及孵育條件、確保組織及時適度固定、優(yōu)化顯色時間并在顯微鏡下監(jiān)控這些方法可有效防止假陰性發(fā)生。

邊緣效應(yīng)。常因滴加抗體未完全覆蓋組織，導(dǎo)致邊緣與中心抗體濃度差異。確保抗體覆蓋劑完全覆蓋組織，孵育環(huán)境保持濕潤就可以避免邊緣效應(yīng)。

脫片。與組織前處理不當(dāng)、切片黏附不佳、抗原修復(fù)過激有關(guān)。應(yīng)優(yōu)化脫水透明程序；使用多聚賴氨酸或APES等處理的防脫載玻片；嚴格控制抗原修復(fù)條件。

8.3質(zhì)量控制體系構(gòu)建

一是建立詳細的SOP是質(zhì)量核心。框架需明確規(guī)定各步驟的操作方法、試劑規(guī)格、濃度、時間、溫度等關(guān)鍵參數(shù)。例如：固定液為 10% 中性緩沖福爾馬林，pH值為7.2～7.4，固定時間 18～24h ，切片厚度 3～4μm 抗原修復(fù)液根據(jù)抗體選擇檸檬酸鹽pH值為6.0或EDTApH值為9.0，修復(fù)條件高壓121 C ，2min或微波中高火， 20min2 ，抗體孵育（一抗4 °C 過夜），顯色（DAB，鏡下控制約 1～5min ）等。

二是對照設(shè)置。陽性對照選擇已知目標(biāo)抗原陽性的組織，與待測樣本同批處理染色，驗證整個實驗體系有效；陰性對照包括空白對照（用PBS）和自身對照。

三是自動化設(shè)備應(yīng)用。自動化設(shè)備能精確控制孵育時間、溫度、試劑添加量，顯著提高結(jié)果一致性

四是進行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷和內(nèi)源性生物素阻斷。

8.4技術(shù)挑戰(zhàn)與未來展望

IHC的核心挑戰(zhàn)在于平衡抗原充分暴露與背景有效控制。標(biāo)準化操作是減少變異的關(guān)鍵。未來研究可關(guān)注：一是分子探針技術(shù)：開發(fā)更靈敏、特異的探針提高檢測精度。二是多色熒光IHC（mIHC/IF）：實現(xiàn)在單張切片上同時檢測多個靶標(biāo)，提供更豐富的空間信息[8。三是人工智能（AI）輔助分析：應(yīng)用AI算法進行陽性區(qū)域識別、定量分析（如H-score）、結(jié)果判讀，提高客觀性、效率和可重復(fù)性。

結(jié)語

免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果的準確性和可靠性受制于從取材到顯色觀察的全流程關(guān)鍵因素。本文系統(tǒng)分析了組織固定、脫水透明浸蠟、切片、抗原修復(fù)、抗體孵育及顯色等環(huán)節(jié)的主要影響因素，并提出了針對性的優(yōu)化對策。有效解決脫片、背景高、信號弱、假陽性/假陰性等常見問題。依賴于對上述關(guān)鍵控制點的精準管控，嚴格執(zhí)行標(biāo)準化操作流程，結(jié)合合理的對照設(shè)置、自動化設(shè)備的應(yīng)用以及嚴格的質(zhì)量控制體系，是提升IHC實驗成功率和結(jié)果可靠性的根本保障。隨著分子探針、多色熒光標(biāo)記及人工智能等技術(shù)的發(fā)展，IHC技術(shù)將在病理診斷和基礎(chǔ)研究中發(fā)揮更精準、更強大的作用。

參考文獻：

[1]李振坤等.免疫組化前處理標(biāo)準化研究進展[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2021，37（5）：543-546.

[2]王明等.組織固定時效性對抗原保存的影響[J].中華病理學(xué)雜志，2020，49（8）：831-834.

[3]張偉，陳紅.自動化染色儀在免疫組化質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2022，38（6）：721-725.

[4]陳敏華等.不同pH修復(fù)液對核抗原暴露的影響[J].中國組織化學(xué)雜志，2022，31（4）：332-336.

[5]劉燕，趙強.免疫組化抗體濃度優(yōu)化方法的對比研究[J]診斷病理學(xué)雜志，2021，28（4）：281-285.

[6]劉偉等.微流控芯片在抗體孵育中的創(chuàng)新應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)裝備，2024，21（1）：45-49.

[7]張立國等.智能監(jiān)控系統(tǒng)在病理前處理中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志，2023，30（2）：112-115.

[8]郭偉，周敏.多色熒光免疫組化技術(shù)的研究進展[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2020，29（2）：183-188.

收稿日期：2025-06-19

作者簡介：張海林（1985—），女，漢族，碩士，工程師。研究方向：病理學(xué)檢測與分析。*通訊作者：呂龍寶（1974—），男，漢族，碩士，研究員。研究方向：實驗動物學(xué)研究。