Circ-USP14調控miR-1307影響胃癌進展的研究

[中圖分類號]R735.2 [文獻標志碼]A [DOI] 10.19767/j.cnki.32-1412.2025.03.001

[Abstract]Objective：To explore theexpresionof circ-USP14 ingastriccancer，andits impactonthedevelopment of gastriccancer.Methods：One hundred gastric cancertissues and their adjacent para-carcinoma tisses were selected. The expresson levelof circ-USP14 ingastriccancer tisses wasassessed byPCR method.Kaplan-Meier survival curve was used toanalyze the survival time of patients in the high-expression group and low-expression group of circ-USP14， andtherelationshipbetween the expresionof circ-USP14and the clinicopathological characteristics of gastriccancer was analyzed.ThegastriccancercellineAGSwascultivated，andthecirc-USP14overexpresionplasmid wasconstructed. Thecells weresetas theVector control groupandthe circ-USP14overexpresion group.Then，the proliferationabilityof gastric cancercellswasdetected bytheEDUassay，andthe migrationabilityofgastriccancercellswasdetectedbyhe Transwellassay.UsetheCircInteractome database topredict miRNAs that mayinteract with circ-USP14.ThepGL3reporter vectors of wild-type （circ-USP14-wt）and mutant （circ-USP14-mut）wereconstructed and co-transfected with miRNC and miR-13O7 intothecels，then thedual luciferase detection system wasusedtodeterminethe interactionbetween circ-USP14 and miR-13O7.Pearsoncorelation analysis wasusedto investigate therelationship between circ-USP14 and miR-1307.Results： The expresion levelof circ-USP14 in gastriccancer tissues was significantly lower than thatin paracarcinoma tissues.The expression level of circ-USPl4 was closely related to tumor diameter （ P =0.003），TNM grade（ P= 0.014），and lymph node metastasis （ P =0.002）.Compared with the Vector group，the proliferationability of gastric cancer cellsinthecirc-USP14overexpression groupsignificantlydecreased，andthemigrationabilitywassignificantlyweakened. The dual luciferase reporterassaydemonstrated that circ-USP14interacted with miR-1307.Pearson corelationanalysis revealedasignificant negativecorrelation between miR-1307and circ-USP14 expression in gastriccancer tisues.EDU experimentindicated thattransfectionofmiR-13O7mimicspromotedcell proliferation，whileoverexpresionofcic-USP14 inhibitedtheeffectof miR-1307mimics.TranswellassayshowedthatmiR-1307mimicspromotedthemigrationof gastric cancer cells，but overexpresson of circ-USP14 inhibited the promoting effct of miR-1307 mimics.Conclusion： The expressionofcirc-USP14ingastriccancerislow，whichisassociated with the malignant biological behaviorof gastriccacer and poorprognosisofpatients.Circ-USP14 inhibits theproliferationand migrationabilitiesof gastriccancercelsbyregulating miR-1307.

[KeyWords] circularRNA;circ-USP14;miR-13O7; gastric cancer

胃癌已成為全球癌癥相關死亡的第三大常見惡性疾病[1-2]，由于早期癥狀不明顯，患者往往在晚期才被確診，其5年生存率低于 20%^[3-4] 。對于局部晚期胃癌手術仍是主要的治療手段，但許多晚期患者并不符合手術條件5。以5-氟尿嘧啶（5-FU）為基礎的化療方案是治療晚期胃癌的首選方法，然而由于胃癌的異質性及耐藥性，化療后復發率較高。因此，探索新的基因表達模式和分子靶點具有重要意義。環狀RNA（circRNA）呈現獨特的閉環分子構型，其 5^′ 端缺乏帽結構， 3^′ 端不存在多聚腺苷酸尾[8-9]，具備抵抗RNA核酸外切酶降解的特性。circRNA通過充當microRNA的“分子海綿”抑制下游信號通路，或通過與RNA結合蛋白（RBPs）相互作用調控蛋白質功能[Io-]。盡管circRNA被歸類為非編碼RNA，但最新研究表明其可能參與蛋白質翻譯過程。circRNA中高度保守的開放閱讀框（ORFs）通過內部核糖體進入位點（IRES）滾環擴增（RCA）或m6A修飾等機制參與細胞增殖、凋亡和炎癥反應等過程[12-13]

本研究收集2014年1月一2015年12月在我科行根治性胃癌切除術的100例患者的胃癌標本，探討胃癌組織中circ-USP14表達的臨床意義及其對胃癌進展的影響，為探求胃癌治療的新策略提供理論依據。

1資料與方法

1.1樣本資料本研究收集100例胃癌組織及其鄰近的癌旁組織標本，獲得醫院倫理委員會批準。

1.2實驗方法

1.2.1實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：TRIzol試劑提取樣本總RNA，利用微量核酸蛋白檢測系統測定RNA濃度。經濃度標準化處理后，應用逆轉錄試劑與熒光定量試劑（TaKaRa公司）將RNA模板轉化為cDNA，進行PCR擴增，以 β-actin 為內參，采用2^-ΔΔα 法進行相對定量。

1.2.2細胞培養：胃癌細胞株AGS[中國生命科學院（上海）采用含 10% 胎牛血清（FBS，Procell，武漢）及1% 青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基培養，置于37°C.5%CO₂ 的濕潤條件下培養。

1.2.3質粒構建與轉染：采用circ-USP14過表達載體（pLVX-puro，Genelily 生物技術公司，上海），Lipo-fectamine30oo（Invitrogen）質粒轉染試劑，在室溫下按試劑盒說明書進行操作。轉染 ^48h 后，使用嘌呤霉素篩選穩定轉染的細胞，培養30天。

1.2.4細胞增殖實驗：AGS細胞經消化處理后，各孔注入 100μL 含 50μM 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl- ?2^? -deoxyuridine，EDU）的培養液，孵育 ^2h 。移除培養液，PBS溶液清洗2次。各孔加入 50μL 細胞固定液，孵育 30min ，再每孔補充 50μL2mg/mL 甘氨酸溶液，置于脫色搖床反應 5min 。移除甘氨酸溶液，加入 100μL PBS 溶液，在搖床上洗滌 5min 。去除PBS，各孔注入 100μL 滲透劑，搖床上孵育1min 。向每孔加入 100μL1×Apollo 染色液，室溫下避光孵育 30min 。各孔補充 100μL 含 0.5% TritonX-100的PBS溶液，在搖床上進行2次洗滌，棄去滲透劑。各孔加入 100μL 甲醇溶液，洗滌2次，每

次 5min 。使用去離子水按100：1比例稀釋試劑F，各孔加入 100μL ，搖床上孵育 30min 。移除染色液，100μL PBS 清洗3次。最終各孔保留 100μL PBS溶液用于后續實驗。染色完成后，進行圖像采集與數據分析。

1.2.5Transwell實驗：實驗體系由24孔板構成，上下培養室通過 8μm 孔徑的聚對苯二甲酸酯膜（康寧公司）實現物理分隔。實驗組將 1×10⁴ 個AGS細胞接種于上室，采用無血清RPMI1640培養基培養，下室填充含 10% 胎牛血清的RPMI1640培養基，置于 37^°C 恒溫 ，5%CO₂ 的濕潤環境下持續培養24h 培養結束后，首先棉簽擦拭濾膜上表面以移除未遷移細胞，隨后采用 4% 甲醛溶液浸泡 10min 固定處理，最后使用 0.1% 結晶紫溶液對遷移至下室的細胞染色 5min ，顯微鏡下觀察與圖像采集。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗：為驗證circ-USP14的調控作用，構建野生型與突變型pGL3報告載體，分別命名為pGL3-circ-USP14-wt和pGL3-circ-USP14-mut。將上述載體分別與miR-NC和miR-1307共轉染至細胞中，經 ^48h 培養后，采用雙熒光素酶檢測系統進行活性測定。其中報告基因活性以螢火蟲熒光素酶與海葵熒光素酶的發光強度比值作為定量指標。

1.3統計學處理應用 SPSS27.0 和GraphPadPrism9.5統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以 表示，組間比較采用獨立樣本 χ_t 檢驗；計數資料以頻數或百分率表示，組間比較采用 χ² 檢驗。運用Kaplan-Meier生存曲線分析生存時間。 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1circ-USP14在胃癌組織中的表達及其臨床意義PCR檢測結果表明，胃癌組織中circ-USP14表達水平低于鄰近的癌旁組織，差異有統計學意義（ Plt; 0.05），見圖1A。根據100例胃癌組織circ-USP14的PCR檢測結果中位數，分為高表達組50例和低表達組50例。Kaplan-Meier生存曲線分析提示，circ-USP14高表達組患者總生存率高于低表達組，差異有統計學意義（ P=0.003 ，見圖1B。

2.2胃癌組織中circ-USP14表達水平與臨床病理特征的關系Circ-USP14表達水平與腫瘤直徑（ P=

0.003）、TNM分級（ scriptstyle（P=0.014 、淋巴結轉移 P=0.002 ）有關，而與患者性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓無關C Pgt;0.05 ）。見表1。

A：胃癌及癌旁組織中circ-USP14表達；B：Kaplan-Meier生存曲線。

圖1circ-USP14在胃癌組織中的表達及臨床意義

表1胃癌組織中circ-USP14表達水平與患者臨床病理特征的關系

2.3circ-USP14抑制胃癌細胞增殖與遷移 EDU細胞增殖實驗顯示，與Vector組比較，circ-USP14過表達明顯抑制胃癌細胞的增殖活力 （Plt;0.01 ，見圖2A、B。Transwell實驗顯示，與Vector組比較，過表達circ-USP14明顯減弱AGS細胞的遷移能力（ Plt; 0.01），見圖2C、D。

2.4circ-USP14通過調控miR-1307發揮作用已有研究證實，circRNA通過結合miRNA影響腫瘤的進展過程，調控相關靶基因的表達水平。基于CircInteractome數據庫分析，我們推測circ-USP14可能與miR-1307存在結合位點（圖3A）。為驗證這一假設，我們分別在胃癌細胞中同時轉染miR-1307模擬物及circ-USP14野生型（wt）或突變型（ Ω_mut 載體。雙熒光素酶報告實驗顯示，當miR-1307表達量增加時，circ-USP14-wt熒光素酶活性顯著下降，而circ-USP14-mut熒光素酶活性未發生明顯改變（圖3B、C）;qRT-PCR實驗顯示，胃癌細胞中miR-1307表達水平明顯上調（圖3D）；Pearson相關性分析顯示，胃癌組織中miR-1307與circ-USP14表達量呈顯著負相關（圖3E）。

圖2Circ-USP14抑制胃癌細胞增殖與遷移

A：CircInteractome數據庫預測circ-USP14與 miR-1307 之間存在潛在的相互作用位點；B-C：雙熒光素酶報告實驗檢測各組熒光素酶活性;D：qRT-PCR檢測 miR-1307 在胃癌組織中的表達水平;E：胃癌組織中circ-USP14與 miR-1307 的相關性（ ^**Plt;0.01 ）圖3Circ-USP14通過調控miR-1307發揮作用

2.5circ-USP14通過調控miR-1307抑制胃癌細胞增殖和遷移為驗證circ-USP14調節miR-1307的作用，將Vector+miR-NC、Vector + miR-1307mimics和 circ-USP14+miR-1307 mimics轉染AGS細胞。EDU細胞增殖實驗顯示，轉染 miR-1307mimics 促進細胞增殖，而circ-USP14過表達抑制miR-1307mimics的作用（圖4A、B）。Transwell實驗顯示，miR-1307mimics 促進胃癌細胞遷移，而circ-USP14過表達抑制miR-1307mimics的促進作用（圖4C、D），提示circ-USP14可能通過調控miR-1307抑制胃癌細胞增殖和遷移。

A-B：EDU細胞增殖實驗檢測各組轉染細胞的增殖活力;C-D：Transwell實驗檢測各組轉染細胞的遷移能力（ ^*Plt;0.05 ^*Plt;0.01 ）。

圖4Circ-USP14通過調控miR-1307影響胃癌細胞增殖和遷移

3討論

近年來環狀RNA（circRNA）作為一種新型內源性非編碼RNA受到廣泛關注，其主要通過microRNA（miRNA）等分子介導的轉錄及轉錄后調控機制而調控基因表達[4。circRNA因結構穩定性和進化保守性，在疾病診斷標志物和治療靶點開發領域展現出巨大潛力[15]。然而circ-USP14在胃癌發生中的作用及其潛在機制尚未明確。

本研究結果顯示，胃癌組織中circ-USP14表達較癌旁組織明顯降低，Kaplan-Meier生存曲線及胃癌臨床病理特征與circ-USP14表達相關性分析表明，circ-USP14低表達患者的預后差，總生存期較短，提示circ-USP14表達降低與胃癌患者的預后不良相關。Circ-USP14表達與腫瘤直徑、TNM分級、淋巴結轉移相關（均 Plt;0.05 ），而與患者性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓情況無關（均 Pgt;0.05 ），表明circ-USP14可能與胃癌的惡性生物學行為相關，其異常表達可能是胃癌發生和進展的重要原因。EDU和

Transwell實驗結果顯示，circ-USP14顯著抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力，生物信息學方法預測及雙熒光素酶報告實驗發現circ-USP14與miR-1307存在相互作用位點，circ-USP14通過調控miR-1307而抑制胃癌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，胃癌組織中circ-USP14低表達，與胃癌的惡性生物學行為及患者預后不良有關，circ-USP14通過調控miR-1307表達而抑制胃癌細胞的增殖、遷移，為胃癌治療和診斷提供了新思路。

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[收稿日期]2025-04-20（本文編輯趙喜）