果蔬中15種農藥殘留快速檢測膠體金免疫層析多聯卡的研制

Development of A Multiplex Colloidal Gold Immunochromatographic Multicard for Rapid Detection of 15 Pesticide Residues in Fruits and Vegetables

NI Weihong'， YIN Danhan’，LI Gaotian1， XIAO Hailong1，LU Huajin2， SHEN Guofang' （1.Hangzhou Institute for Food and Drug Control Science，Hangzhou 31oo18， China; 2.Hangzhou Aomin Biotechnology Co.， Ltd.， Hangzhou 310019， China）

Abstract： In order to meet the needs of rapid detection of a variety of specific pesticide residues in fruits and vegetables，based oncoloidal gold immunochromatography technology，this paper developed acolloidal gold immunochromatographic multicard for the simultaneous rapid detection of 15 pesticide residues，such ascarbofuran， methocarb and profenofos，by optimizing the key factors such as coloidal gold-monoclonal antibody conjugate concentration and artificial antigen coating concentration.The test results showed that the detection limit of 15 pesticide residues was 0.01mg?kg^-1 to 0.3mg?kg^-1 ， no 1 negatives were found， the 1 positive rate was less than （20 5% ，and the specificity and accuracy were greater than 95% .A total of2 516 batches of samples were tested， and 6 batches of positive samples were detected.This method has good accuracy and simple operation，and is suitable for high-throughput rapid screening and detection of pesticide residues in vegetables and fruits.

Keywords： fruits and vegetables; pesticide residues; rapid detection; coloidal gold immunochromatographic multicard

我國各大農貿市場的果蔬農殘監測以快速檢測為主，其中膠體金免疫層析技術（GoldImmuneChromatographicAssay，GICA）因其便捷性成為主流方法[1-5]。由于抗原與抗體一一對應特性，單個抗體的檢測卡僅能檢測一種目標物，難以滿足多種特定農藥殘留同時篩查檢測的需求，而個性化定制的多聯卡則可解決這個問題[6-7]。目前，可同時檢測果蔬中多種農殘的多聯卡技術報道較少[8]。本文基于競爭性GICA法，研制出15種常見農藥殘留（克百威、滅多威、丙溴磷、甲基異柳磷、辛硫磷、多菌靈、吡蟲啉、吡唑醚菌酯、甲霜靈、噻蟲嗪、氯蟲苯甲酰胺、水胺硫磷、百草枯、三唑磷和蠅毒磷）同步快速檢測多聯卡，并對檢測卡的主要性能指標進行評價，旨在為我國蔬果中多農藥殘留的個性化、高通量快速檢測以及食品安全提供科技支撐和技術保障。

1材料與方法

1.1材料與試劑

水果、蔬菜樣品，購于當地農貿市場。

農藥標準品，壇墨質檢科技股份有限公司；抗體及抗原，江南大學；牛血清白蛋白、檸檬酸三鈉、氯金酸溶液，美國Sigma公司；羊抗鼠二抗，北京博奧龍免疫技術有限公司；聚乙二醇20000、聚乙烯吡咯烷酮、吐溫-20，上海Aladdin公司；硝酸纖維素膜，德國Sartorius公司。

1.2儀器與設備

UV-2550紫外-可見光分光光度計（日本島津公司）；單通道及多通道可調移液器（德國Eppendorf公司）；超純水儀（美國Pall公司）；Allegra64R臺式高速離心機（美國Beckman公司）；SpectraMax@i3多功能酶標儀（美國MolcularDevices公司）；Mastersizer2000激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；WEF-100噴金劃膜一體機（威爾芬）；WEF-200可編程自動切條機（威爾芬）；AMYQ-MR智能讀卡儀（傲敏生物）。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠體金溶液制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，主要步驟如下：取 247.5mL 蒸餾水，加熱至沸騰，加入2.5mLl% 的 HAuCl₄ ，加速攪拌，取 7.5mL 檸檬酸三鈉，迅速加入沸騰的金溶液中，繼續攪拌煮沸30min 即可。

1.3.2 標記抗體濃度及pH值優化

采用棋盤法優化標記抗體濃度和pH值。用0.01mol?L^-1 的PB緩沖液（ pH=7.4 ）分別將15種農藥單克隆抗體配制成 1.0mg?mL^-1 溶液。取多只小試管，各加入 1mL 膠體金，分別加入2、4、6、 8μL 和 10μL 單克隆抗體，再分別加入 碳酸鉀（ 0.1molL^-1 ）使各個小管的pH值在 8～9 ，渦旋混勻，靜置 10min 。每只小試管加人 牛血清白蛋白（BovineAlbumin，BSA），渦旋靜置 10min 向每只小試管中加入1mL 10%NaCl 溶液， 5min 后觀察各管溶液顏色變化。選擇不變色、 pH 值較高、抗體添加量最小的組合作為最佳體系。

1.3.3 T/C線包被濃度優化

T線上分別包被克百威等15種抗原，抗原濃度分別設置為0.35、0.50、0.65、 0.80mg^.mL^-1 和0.95mg?mL^-15 個濃度。C線包被羊抗鼠二抗，濃度分別設置為 0.1，0.2，0.3，0.4mgmL^-1 和 0.5mgmL^-1 5個濃度。PB緩沖液（ （0.01mol?L^-1 ）作為空白對照溶液，利用金標抗體溶液進行顯示反應，選擇T和C線顯色清晰且讀卡儀測量后讀數基本一致、包被濃度最低的作為最優濃度。

1.3.4 多聯卡的組裝

將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在聚氯乙烯（PolyvinylChloride，PVC）底板上，用噴金劃膜一體機噴捕獲線（T/C線）。多聯卡的組裝采用物理拼接方式，即每個檢測通道可以檢測1個項目，通過增加檢測通道實現二聯、三聯、四聯、五聯等多聯卡組裝。拼裝好的15種農藥殘留檢測卡見圖1。

1＼～15依次為克百威、滅多威、丙溴磷、甲基異柳磷、辛硫磷、多菌靈、吡蟲啉、吡唑醚菌酯、甲霜靈、噻蟲嗪、氯蟲苯甲酰胺、水胺硫磷、百草枯、三唑磷和蠅毒磷。

2 結果與分析

2.1 工作溶液參數

由于各農藥單克隆抗體及相應人工抗原的蛋白活性有所差異，且所需的工作條件與試劑具體參數不一，故對工作溶液參數進行優化以達到最佳效果。按照1.3.2項方法，采用鹽沉淀法進行膠體金標記單克隆抗體最適標記量優化，通過棋盤法測試發現，15種農藥殘留檢測體系的工作溶液最佳標記 pH 值在8.0～8.7 ，最適抗體添加濃度在 2.0～8.0mg?L^-1 。

按1.3.3項方法，通過棋盤法試驗，調節包被在T線和C線的競爭抗原和二抗的工作濃度，根據T、C線的顯色情況，篩選出包被試劑最優的工作濃度條件。結果發現，各農藥的T線包被抗原最佳工作濃度在 0.35～0.95mg?mL^-1 ，而C線包被二抗工作濃度則在 0.1～0.5mg?mL^-1 。各農藥殘留檢測卡的最佳標記pH值、抗體添加濃度、T線和C線包被工作濃度詳見表1。

2.2 對標準溶液的檢出限

采用不同濃度的農藥標準溶液對試劑卡檢出限進行測試，以獲得試劑卡在不受干擾的理想狀態下的檢出限，即在經驗證結果為陰性的樣品中，在適量范圍內從高濃度到低濃度分別加入農藥標準品，使其在測試中肉眼可觀察到T線顯色逐漸變深，重復10次，當T線顯色的深淺接近C線且可明顯區分時的濃度即為試劑卡對標準溶液的檢出限。各農藥殘留檢測卡對標準溶液檢出限見表1。

2.3樣品前處理參數

分別稱取樣品 1、2、3、4g 和 s_g ，采用攪碎、剪碎兩種破碎方式，分別用Tris-HC1緩沖液和PB 緩沖液進行提取，比較篩選合適的前處理方法。結果發現，攪碎方式處理的樣品農藥提取效果欠佳，故選用剪碎方式。此外，實驗還發現當稱樣量大于2g 時，樣品中農藥量達到飽和，這時T/C值不再隨稱樣量增加而減小，因此本文選擇 2g 作為最優取樣量。在此取樣量基礎上，加入 5mL 提取液時，T/C值最小，故確定提取液用量為 5mL 。比較兩種緩沖液的提取效果，結果發現PB緩沖液T/C值明顯低于Tris-HC1緩沖液，表明PB緩沖液提取效果更佳。

2.4多聯卡性能驗證

每種農藥殘留檢測卡采用200個樣品進行驗證，其中陰性樣品50個（生姜、甘藍、菠菜、火龍果、番茄各10個，陽性樣品同）；陽性樣品按低、中、高3個水平加標濃度開展實驗（各50個），其中低濃度設置為試劑卡對標準溶液檢出限，低、中、高濃度按3倍左右遞增。考察多聯卡靈敏度、準確性、特異性等，所得結果見表2。

靈敏度為檢測陽性的樣品數量占理論上總陽性樣品數的百分比，取靈敏度為 100% 時的濃度為實際樣品檢測限。驗證結果表明，部分農藥殘留檢測卡的檢測限與其對標準溶液檢出限一致，反映出該檢測體系不受樣品的干擾，如克百威、辛硫磷等；但大部分農藥殘留檢測卡在實際樣品測試時受到一定的干擾。15種農藥殘留檢測卡實際樣品檢測限在（204號 0.01～0.3mg^.kg^-1 。

在實際樣品檢測限水平測試多聯卡的假陰性率、假陽性率、特異性和準確率，假陰性率為理論上總陽性樣品數中檢測為陰性樣品數的百分比；假陽性率為理論上總陰性樣品數中檢測為陽性樣品數的百分比；特異性實驗采用15種農藥與檢測卡互相交叉檢測，即測試特定農藥的檢測卡對其余14種農藥的抗干擾性，用檢測出陰性樣品數占理論上總陰性樣品數的百分比表示；準確率為檢測結果符合理論結果的百分比。測試結果顯示，15種農藥殘留檢測卡的假陰性率均為 0% ；假陽性率大部分為 0% ，其余幾種均 lt;5% ；農藥殘留的特異性和準確性均 gt;95% 。以上結果表明本實驗制備的15種農藥殘留檢測多聯卡的性能優良。

2.5 實際檢測應用

在某大型賽事活動中，采用本文開發的膠體金快檢多聯卡共檢測2516批次果蔬樣品，共發現6批次果蔬農藥殘留陽性，分別為1批紅椒絲（多菌靈）、2批黑布林（噻蟲嗪）、2批黃瓜（甲霜靈）、1批草莓（吡唑醚菌酯）。將6批次陽性送至實驗室，采用液相色譜質譜聯用檢測方法進行確認，與膠體金判斷結果一致。

3結論與討論

農藥殘留快速檢測卡的準確度和檢測限與所用的抗體質量直接相關。此外，樣品的破碎方式也是重要影響因素。部分農藥具有內吸性，而過度破碎導致樣品呈膠狀，該狀態容易吸附農藥，同時也會釋放出細胞內容物，干擾檢測結果，影響檢測結果準確性。故選擇破壞程度較輕的剪碎方式，這不僅可使農藥殘留充分析出，還能避免對樣品組織的過度破壞。

對于快速檢測卡而言，檢測限過高或過低均不利于實際應用，過低會導致假陰性結果，過高則會使在國家安全標準規定的最大殘留限量范圍內的果蔬產品也檢出陽性結果，不利于安全果蔬產品的快速通行。故本文在方法開發時經過反復實驗，使15種農藥殘留檢測卡的檢出限數值與國標要求基本一致或略高，大大提高了檢測卡的應用性能。

經樣品加標測試，大部分農藥殘留檢測的準確率為 100% ，少數幾種準確率在 95% 以上，可滿足快速檢測要求。該多聯卡在某大型賽事活動中得到了實際應用，檢測情況良好。

綜上，本文研發的果蔬中15種農藥殘留快速檢測膠體金免疫層析多聯卡準確性好、可靠性高、操作簡單，具有極高的應用和推廣價值。

參考文獻

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