果膠酶在半夏疏松愈傷組織形成中的作用研究

關鍵詞：半夏；疏松愈傷組織；果膠酶中圖分類號：Q945.5文獻標識碼：A文章編號：1008-0457（2025）03-0079-09國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.011

半夏（Pinelliaternata（Thunb.）Breit.）為天南星科多年生草本植物，是我國傳統重要中藥材之一，以其燥熱化痰、降逆止嘔等藥效著稱[1]。最新研究表明，半夏具有抗生育、降血脂以及治療冠心病等功效[2-3]。由于近年來對野生半夏的掠奪性挖采以及環境變化，其自然資源面臨枯竭，市場供需矛盾日益尖銳。人工種植是解決半夏市場需求的主要途徑，但長期采用塊莖繁殖導致病害嚴重[4]、種質退化[5-7]、產量下降[8-9]等一系列問題。人工種子相比于半夏種莖具有低生產成本的優勢，因此，半夏人工種子技術已成為近年來的研究熱點[10-12]松散狀的愈傷組織生命力旺盛、增殖快、易分散，是懸浮培養生產人工種胚的理想材料，經過細胞懸浮培養可獲得大量質地均一且易分散的同步化人工種胚。因此，明確半夏疏松愈傷組織形成的關鍵因素，掌握穩定且高效誘導半夏疏松愈傷組織的方法對構建半夏人工種子生產中人工種胚培養技術具有重要意義。

植物組織細胞壁結構和成分含量的變化通常對細胞間連接產生顯著影響，最終反映在植物組織的整體結構和質地上[13]。植物細胞壁胞間層的主要成分是果膠質，負責粘連相鄰細胞。當細胞中果膠物質在果膠酶的作用下發生降解，直接影響果膠含量和空間結構，細胞壁出現內部分子結構解離，細胞形態和大小發生變化，細胞間中膠層和初生壁受到影響，植物組織質地最終發生變化[14-17]。胡留申等18發現桃的質地與細胞壁原果膠含量呈極顯著正相關，同時與水溶性果膠含量、果膠酶活性呈極顯著負相關。陳發河等[19]研究發現，植物生長調節物質能夠促進葡萄果實脫落，增強果膠酶的表達，并隨之引起細胞壁結構的改變。陸玲鴻等[20]研究表明，弼猴桃果實軟化過程與細胞壁中果膠降解相關酶的活性變化密切相關。胡珊珊等[2研究表明，疏松愈傷組織的果膠含量顯著高于致密愈傷組織。這些都初步證實了果膠酶在半夏愈傷組織形態轉化中的關鍵作用。

本研究通過直接添加外源果膠酶，驗證果膠酶對半夏愈傷組織形成的影響，同時探究誘導愈傷組織內源果膠酶活性變化的適宜條件，分析光照強度、蔗糖濃度、植物激素、多胺類物質等因素對果膠酶活性的影響，從而促進半夏疏松愈傷組織的形成，以期為半夏疏松愈傷組織形成的關鍵性因素提供有力依據，為優化培養半夏疏松愈傷組織關鍵技術體系提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1材料

半夏（Pinelliaternata（Thunb.）Breit.）由貴州省赫章縣半夏藥材基地（北緯 27^°28^′ ，東經 104^°34^′ 海拔 2199.67m 提供。

1.2 試驗方法

1.2.1半夏愈傷組織誘導

選取苗齡 30d 的半夏無菌苗葉片為外植體。以MS為基本培養基，加入蔗糖 40g/L ，瓊脂 7g/L 并添加 1.0mg/L 2，4-D 和 0.5mg/L6?BA 。培養條件：培養基 pH5.8 ，培養溫度（ 25±1）^eC ，光照強度 900～1200lx 。

1.2.2半夏不同愈傷組織細胞壁結構觀察

組織結構觀察采用常規石蠟切片法[22]，選取不同的愈傷組織，用 50% 酒精-乙酸-福爾馬林（FAA）固定液固定過夜，經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、復水、番紅/釘紅-固綠染色、脫水、中性樹膠封片等步驟制成切片，最后在光學顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.3探究外源果膠酶對半夏疏松愈傷組織形成的影響

選取2次繼代且生長一致的疏松愈傷組織，配置不同果膠酶活力 （0，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0U/mL） ）的溶液，經 0.45mm 細菌過濾器過濾后，加入培養基中。培養觀察愈傷組織的形態變化，15d后取樣測定果膠含量。

1.2.4誘導愈傷組織果膠酶的培養條件

選取2次繼代以后生長一致的疏松愈傷組織，設計光照強度 1800～2000.2500～3000kx） 、蔗糖質量濃度（0、10、30，40，50，60g/L ）、多胺類物質（精胺、亞精胺、腐胺） （0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mg/L） 、植物激素質量濃度2，4-D（ （0.5，1.0，2.0mg/L ）、IAA（0.5、1.0、2.0mg/L ） ，6-BA（0.5，1.0Ω，2.0mg/L） ）的單因素試驗進行培養，每個處理30瓶，3次重復。 15d 后取樣測定果膠酶活性，同時觀察愈傷組織的形態、質地變化。

1.2.5 相關指標測定

水溶性果膠、原果膠的提取與測定采用咔唑-濃硫酸比色法[23-24]；果膠酶的提取與測定主要基于多聚半乳糖醛酸酶，采用DNS比色法[25-26]。

1. 2.6 數據分析

應用Microsoft Excel 2010、DPS 7.05、GraphPadPrism7.0和AdobeIllustratorCC2017軟件進行數據和圖像處理。

2 結果與分析

2.1半夏不同愈傷組織的細胞壁結構差異

在獲得半夏愈傷組織的基礎上，選擇初代誘導和增殖培養中得到的四種不同愈傷組織進行細胞壁結構差異觀察，包括黃色胚性疏松愈傷組織I、透明松散愈傷組織II、白色松軟愈傷組織III、黃色致密愈傷組織IV，觀察它們的組織與細胞形態差異。I型愈傷組織結構疏松、質地松脆易分散，嫩黃色顆粒狀分布，膨大生長，增殖迅速，細胞結構顯示其核質比大、內含物豐富，細胞分裂旺盛，具有分化成體細胞胚的能力（圖1-a）;II型愈傷組織主要出現在初代誘導的半夏愈傷組織中，透明且含水量高，呈雪花狀，生長緩慢。這些細胞形態飽滿，細胞核較大，內含物豐富，但細胞分裂進度減緩，分裂能力不高（圖1-f）;II型愈傷組織結構松軟、具有黏性，白色或透明，生長緩慢，細胞多為圓形，核小，少有分裂的細胞（圖 _1-g ）；IV型愈傷組織致密結塊團，容易發生器官分化，難以繼代增殖，細胞核較大，分裂能力強（圖1-h）。

2.2外源果膠酶對半夏疏松愈傷組織形成的影響

在培養基中添加不同果膠酶活力的溶液進行培養，結果發現添加了果膠酶液的培養基中，愈傷組織生長更加旺盛，且愈傷組織質地更加疏松（圖2-a和圖2-b）。經過果膠含量測定結果表明（圖3），隨著外源果膠酶活力的提高，愈傷組織水溶性果膠逐漸增加，原果膠含量逐漸減少。從圖1可知，當添加的果膠酶液活力超過 20.0U/mL 時，愈傷組織出現明顯的疏松增殖的現象。然而，當用含果膠酶液的培養基進行培養超過25d后（圖2-c和圖2-d），愈傷組織基本停正增殖，生長緩慢，有的甚至出現褐化、污染的現象。

注：a為未添加果膠酶液培養15d的處理；b為添加果膠酶活力為 20.0U/mL 的酶液培養15d的處理;c為未添加果膠酶液培養25d的處理；d為添加果膠酶活力為 20.0U/mL 的酶液培養25d的處理。

2.3不同光照強度對半夏愈傷組織果膠酶誘導的影響

測定不同光照強度下培養的半夏疏松愈傷組織的果膠酶活性，結果表明（圖4-a），隨著光照強度的增加，愈傷組織果膠酶活性持續增強，但當光照強度達到某一閾值后，果膠酶活性出現減弱的現象。在 1800～2000lx 的光照強度下，半夏疏松愈傷組織細胞壁果膠酶活性達 4.87U/g ，此時，水溶性果膠含量相對較高（圖4-b），愈傷組織質地較為疏松，且呈現旺盛的增殖狀態。因此可知，此條件下，果膠酶活性適合半夏疏松愈傷組織的形成。隨著光照強度的增加，果膠酶活性逐步增強，但光照強度過高時，部分果膠酶失去活性，愈傷組織質地不再均勻疏松，局部出現白色脈絡狀組織，愈傷組織開始變得致密化（圖5-a）。

2.4不同質量濃度的蔗糖對半夏愈傷組織果膠酶誘導的影響

由圖6-a所示，隨著蔗糖質量的增加，果膠酶的活性呈現出逐步增強的趨勢，二者之間呈現顯著正相關關系。當蔗糖質量濃度達到 60g/L 時，果膠酶的活性達到峰值，為 5.14U/g 。此時，原果膠的含量顯著下降至152. 77μg/g ，而水溶性果膠的含量則增加至 120.43μg/g （圖6-b）。然而，過高的酶活性導致果膠降解過度，進而引發愈傷組織出現水漬化現象，質地變得松軟（圖5-b）。綜合來看，誘導果膠酶活性最適宜的蔗糖濃度為 40g/L ，此時果膠酶活性保持在 4.31U/g ，疏松愈傷組織呈現出嫩黃色，表面膨脹突起，生長狀態旺盛，

2.5不同多胺類物質對半夏愈傷組織果膠酶誘導的影響

本試驗測定了3種多胺類物質在不同濃度條件下對愈傷組織果膠酶活性變化的影響。由圖 7-a 可知，腐胺濃度升高導致了果膠酶活性逐漸減弱，原果膠含量增加，水溶性果膠含量減少。在較低腐胺質量濃度條件下 （0.5～1mg/L 果膠酶活性相對較高，處于 3～3.24U/g 范圍內。對于精胺處理組，果膠酶的活性普遍較低，最高為 1.94U/g ，最低為 1.44U/g ，在精胺濃度為 5mg/L 時，果膠酶活性達到最高，隨后隨著濃度的增加而降低；在精胺濃度為 1μg/g 時，原果膠含量最高，隨后逐步減少（圖7-b）；水溶性果膠含量呈不規則變化（圖7-c），但此時半夏愈傷組織的質地仍然主要呈現為堅硬結塊化，生長也較緩慢（圖5-c）。亞精胺的濃度變化對果膠酶活性的影響并不顯著，果膠酶活性始終穩定在 2.15～2.62U/g 之間，此時愈傷組織的質地沒有明顯變化，但果膠酶活性普遍高于精胺處理組。整體而言，多胺類物質處理中，果膠酶的活性雖有變化但整體普遍較低，均在 1.44～3.24U/g 的范圍內，說明多胺物質對半夏愈傷組織果膠酶活性的增強作用相對有限。

注：a為多胺類物質對愈傷組織果膠酶活性的影響;b為多胺類物質對愈傷組織原果膠含量的影響;c為多胺類物質對愈傷組織水溶性果膠含量的影響。

2.6不同植物激素對半夏愈傷組織果膠酶誘導的影響

由圖8可知，在植物激素的作用下愈傷組織果膠酶活性出現明顯的波動，隨著2，4-D濃度的增加，果膠酶活性逐漸增強，當培養基中有 2.0mg/L 的2，4-D時，愈傷組織果膠酶的活性達到 5.07U/g （圖8-a），原果膠含量減少，水溶性果膠含量增加到 99.35μg/g （圖8-b至c），同時產生的愈傷組織質地疏松（圖5-d），保持胚性增殖。高濃度的IAA也會誘導產生高活性的果膠酶，當IAA質量濃度為 2.0mg/L 時，果膠酶活性達到 6.79U/g ，原果膠大幅降解，水溶性果膠大量生成，此時的愈傷組織質地也變得松軟（圖5-e）。6-BA誘導果膠酶釋放活性的能力與IAA相反，隨著6-BA濃度的升高，果膠酶活性明顯減弱，僅占同在 2.0mg/L 質量濃度下IAA誘導的果膠酶活性的三分之一，原果膠降解少，水溶性果膠的生產量較低，此時愈傷組織逐漸致密、結團塊，愈傷組織局部呈綠色，生長速度慢（圖5-f。不同植物激素的處理結果表明，生長素誘導果膠酶活性作用較明顯，而細胞分裂素則相對較弱。然而，過強的果膠酶活性可能導致原果膠過度降解，水溶性果膠大量生成，進而促使細胞壁及胞間層結構松散，使愈傷組織變得松軟甚至喪失增殖活力。因此，單獨添加高濃度的2，4-D或較低濃度的IAA能夠誘導果膠酶發揮較高活性，適度酶解原果膠，減少細胞間的連接，從而獲得質地疏松、分裂旺盛的半夏疏松愈傷組織。

注：a為植物激素對愈傷組織果膠酶活性的影響;b為植物激素對愈傷組織原果膠含量的影響；c為植物激素對愈傷組織水溶性果膠含量的影響。

3 討論與結論

質地疏松、增殖旺盛、具有胚性、生長迅速的疏松愈傷組織是懸浮培養生產人工種胚的理想材料，這類愈傷組織能夠在細胞懸浮培養中分散，形成懸浮的單細胞或小細胞團，不斷分化發育形成胚狀體或者小塊莖[27-28]。植物細胞壁具有多層結構，包括胞間層、初生壁、次生壁。其中，最重要的是連接相鄰兩個初生壁之間的胞間層，其主要成分是果膠質[29]。研究表明在果膠酶作用下，細胞壁物質發生分解，細胞間連接減弱，植物組織質地變得軟化或疏松[30-31]，這與本研究結果具有相似之處。本研究直接在半夏疏松愈傷組織培養中添加外源果膠酶液，當酶液活力超過 20.0U/mL 時，愈傷組織的質地更加松散，生長更加旺盛，表明半夏愈傷組織的質地與細胞壁果膠酶活性的變化密切相關，與李智超等[32在豆腐柴愈傷組織誘導及細胞懸浮培養研究中的結果一致。然而，當培養時間超過25d后愈傷組織出現褐化現象。這可能是由于過長的培養時間導致酶液失活或其對愈傷組織作用過強

而導致的[33-34] 。

在組織培養過程中，存在許多影響愈傷組織形成的因素。已有研究表明，光照強度、蔗糖濃度、多胺類物質、植物激素對植物愈傷組織誘導具有重要作用[35-38]。本研究通過單因素試驗分析4種因素各自對果膠酶活性的影響，結果表明當果膠酶活性過高時，愈傷組織容易出現白化、濕軟的現象，而酶活性較低時，愈傷組織會變得堅實、結塊化，難以形成疏松愈傷組織。其中，當果膠酶活性保持在4～5U/g 的范圍時，半夏疏松愈傷組織容易呈疏松易分散的顆粒狀，保持著良好的生長狀態。這與茄子、梨等多種植物的質地變化與果膠酶和果膠的相關性研究結果一致[3941]。隨著光照強度、蔗糖、2，4-D和IAA的濃度的升高，果膠酶活性增強，而腐胺、6-BA濃度與果膠酶活性呈現負相關的趨勢，亞精胺對果膠酶的活性幾乎沒有影響。其中光照、蔗糖和植物激素能夠明顯提高半夏疏松愈傷組織果膠酶活性，均維持在 4～7U/g 之間，而多胺類物質對果膠酶活性提升的作用普遍較低，其培養下的半夏疏松愈傷組織的果膠酶活性大約在 1.44～ 3.24U/g 。因此我們初步篩選認為誘導內源果膠酶活性達到利于半夏疏松愈傷組織形成的范圍的主要條件中，適宜光照強度為 1800～2000lx ，蔗糖質量濃度為 40mg/L ，植物激素為 2.0mg/L 的2，4-D和 1.0mg/L 的IAA。

本研究進一步優化了半夏愈傷組織培養條件，并對半夏的大規模生產、人工種子培養提供了重要的理論依據與試驗參考。但在半夏疏松愈傷組織的形成中，影響果膠酶活性以及植物愈傷組織質地的因素包括但不限于本研究所提到，其中，對酶活性影響較大的溫度、pH值等因素在植物培養過程中具有常規范圍，并且對半夏疏松愈傷組織進一步探究其人工種子的影響因素也更為復雜。葉玲娟等[42]發現接種量對相思樹的愈傷組織形成具有顯著影響。李晉華等[43]對小黃姜人工種子技術的研究中，對溫度等多種培養因素進行調整，探索得到能使人工種子萌發率和成芽率達到最高的培養條件。在這些常規有效范圍內如何既能保證植物組織的正常生長發育，又能達到誘導果膠酶活性變化的目的，最后獲得理想狀態的培養材料，獲取到植物人工種子，值得進一步探究。

（責任編輯：嚴秀芳 胡吉鳳）

作者簡介：羅伶俐（2004—），女，漢族，貴州大學生命科學學院 2023級生物技術專業本科生，E-mail：2263555326@ qq. com.

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Studyon the Role of Pectinase in the Formation of Loose Callus of Pinellia ternata

Luo Lingli， Tian Yuhang，Hang Ye，Long Zhengxi，Tang Liu，Liu Miao*

（SchoolofLife Sciences，KeyLaboratoryofMountain Plant Resources Conservationand Germplasm Innovation，Ministry

ofEducation），Guizhou University，Guiyang 55oo25，Guizhou，China）

Abstract：ToexploretheroleofpectinaseintheformationofPinelliaternataLoosecallusanditsoptimal induction conditions， P . ternata calls was used as experimental materials，the appropriate conditions for inducing changes in endogenous pectinase activity in the calls was investigated by directly adding exogenous pectinase solution，and he efectsof diffrent light intensities，sucrose concentrations，phytohormones，and polyaminecombinationsof treatments on the pectinase activity were studied.The results showed that，（1）When exogenous pectinase solution was added directlyintotheculture mediumandtheenzymeactivity exceeded 20.O U/mL，the textureof thecalus was obviously loosenedwith significantlyaccelerating of the growth，which proved thattherewasacloserelationshipbetweenthe texture of the callus of P . ternata and the changes of the pectinase activity in the cell wall. （2）under the experimental conditions，when the concentrations of sucrose， ^2，4 -D，and IAA were elevated as well as the light intensity was enhanced，thepectinaseactivityshowedanincreasing trend，onthecontrary，theelevatedconcentrationsof putrescine and 6-BA ledtoadecrease in pectinaseactivity；whereas pectinase activitydid not difer with the concentrationof spermine.Among them，light，sucrose and phytohormones significantly increased the pectinase activity of P .ternata loose callus to 4 ＼～7 U/ g ，while the effect of polyamines was weak，with the pectinase activity of the callus only ranging from 1.44 to 3.24 U/ g .The results of this paper showed that the key condition for endogenous pectinase activity to reach the appropriate range （4＼～5U/ g ）concludes sucrose of 40g/L ， ^2，4 -D of 2.0 mg/ L ， IAA of 1.0 mg/L and light intensity of 1800～2000 lx in MS medium，which could promote the formation of loose callus of P ternate.

Keywords：Pinellia ternata；loose callus;pectinase