基于TaqMan探針的柑橘黃龍病菌亞洲種實時熒光PCR快速檢測方法

關鍵詞：柑橘黃龍病；柑橘黃龍病菌亞洲種；快速檢測；實時熒光PCR中圖分類號：S436.66 文獻標識碼：A文章編號：1008-0457（2025）03-0074-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.010

柑橘是世界上第一大類的水果，在世界農產品交易中占據十分重要的位置，全球有近140個國家和地區生產柑橘，我國是柑橘的起源中心之一，近年產量位居世界前列。柑橘黃龍病（Huanglongbing，HLB）是對柑橘生產危害性最大的一種病害，主要分布在東南亞、非洲、美洲等近50個國家和地區，對柑橘產業的發展有著巨大的影響[1]。此病原根據其16SrDNA和 β -操縱子基因的序列特征以及其自身的性質可分為3個種，即亞洲種（CandidatusLiberibacterasiaticus）非洲種（CandidatusLiberibacterafricanus）和美洲種（CandidatusLiberibacter americanus）[1-2]。其中，亞洲種的分布最廣泛，危害最為嚴重。該病菌可通過媒介昆蟲-柑橘木虱進行近距離的傳播，也可以通過帶病的苗木、接穗傳到更遠的地區。果樹一旦染病，會導致樹勢快速衰退，并伴有黃化葉、畸葉、根系腐爛以及果實瘦小發綠等癥狀，若不能提前防治，短短幾年便能導致果園喪失生產價值，甚至于毀園。HLB能侵染各類的柑橘植物。染病癥狀明顯的主要是甜橙、柑橘和橘柚，在檸檬、葡萄柚、酸橙、金桔和香橡等植株上出現的癥狀稍弱，在青檸和柚子的癥狀更弱[34]。H HLB的出現對全世界的柑橘生產帶來了巨大的影響。

在我國，柑橘黃龍病主要發生在南方局部地區，病原為柑橘黃龍病菌亞洲種（CandidatusLiberibacterasiaticus，CLas），是一種韌皮部桿菌，屬于革蘭氏陰性細菌（Bacteria）變形桿菌門（Proteobacteria）變形菌綱（Alphaproteobacteria）根瘤菌目（Rhizobiales）葉桿菌科（Phyllobacteriaceae），該病菌目前無法進行室內培養。

目前，我國農業部門及口岸檢疫部門對柑橘黃龍病菌亞洲種的檢疫鑒定是按照出入境檢驗檢疫行業標準《亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法》（SN/T2071—2008）[5]進行，主要是通過對樣品DNA進行PCR擴增測序后通過BLAST比對進行鑒定[4]該方法耗時較長，難以實現口岸快速檢測。國內外對柑橘黃龍病菌亞洲種的檢測技術也有一些相關研究。 Li^[6-8] 等根據16SrDNA、核糖體蛋白基因rpl/rpll、還原酶 β 亞基的nrdb基因序列設計相關檢測方法，但均主要集中在對柑橘黃龍病菌或單個種的檢測，缺少對柑橘黃龍病菌3個種之間的區分；本研究在強化亞洲種鑒別的基礎上，主要針對亞洲種的檢測，并加入與非洲種和美洲種作為對照。隨著分子生物學技術的進一步發展，實時熒光PCR技術在植物病原檢測方面得到了廣泛的應用，相比于普通PCR，它能做到時間短、靈敏度更高的檢測，是目前常用且可靠的方法[9-10]。為做到柑橘黃龍病菌亞洲種的快速檢測以及相似種的區分，本研究根據亞洲種核糖體蛋白基因 rplj/rpll^[11] ，建立了一套實時熒光PCR快檢體系，為口岸快檢柑橘黃龍病菌亞洲種提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

供試樣品共27個（表1），包含19個柑橘葉片樣品、1個黃龍病非洲種rp質粒、1個黃龍病美洲種rpj質粒以及6個柑橘上常見且易與柑橘黃龍病癥狀混淆的病害樣品。上述兩個質粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試劑和儀器

磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒購自珠海寶瑞生物公司、Premix Taq^°ledast Version 2.0、Premix ExTaq（ProbeqPCR）購自寶生物（大連）有限公司、球磨儀MM400（德國萊馳）、全自動核酸提取儀KingfisherDuoprime（賽默飛世爾）、超微量核酸蛋白檢測儀NanoDropone（賽默飛）、熒光定量PCR儀（A）。引物探針及質粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA提取

用 75% 的酒精擦洗樣品表面，清水沖洗后晾干，再用液氮浸泡后研磨成粉。按照磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒的說明書方法對樣品進行DNA提取，所得DNA通過超微量核酸蛋白檢測儀測定核酸濃度和質量，保存于 -20°C 冰箱。

1.4 引物設計

根據柑橘黃龍病菌亞洲種及其近似種的rpj基因序列的差異，利用PrimerExpress3.0軟件設計特異性引物lasf（ 5^′ -CCAACGAAAAGATCAGATATTC）、lasr（ 3^′ -AAGGGAATTAGTGTTGCG）和特異性探針laspr（ROX-CACGGATAGCAATCTTGACGAGAC-BHQ2），擴增產物大小預計為 80bp 。以上引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 特異性試驗

以表1中各地采集的樣品DNA為模板，無菌水為空白對照，進行實時熒光PCR反應，反應體系 Premix Ex Taq（Probe qPCR） 、0.5μL 引物lasf ∴0.5μL 引物lasr ∴0.5μL 探針 laspr，2μL DNA，其余用無菌水 6.5μL 補至 20μL 。反應條件為： 95^°C 預變性30s;然后以95℃5s， 60°C30s 進行40個循環。在單個循環結束時設置熒光通道采集熒光信號。

1. 6 靈敏度試驗

為了明確該實時熒光PCR對柑橘黃龍病菌亞洲種DNA濃度的檢測限度，以染病樣品HL13為模板，用無菌水按照10倍的濃度梯度進行稀釋，共稀釋7個濃度梯度，并以每個濃度兩個重復進行PCR試驗，利用1.5中的實時熒光PCR方法進行擴增測試，測定各濃度的靈敏度并繪制標準曲線。

1.7 重復性試驗

用樣品HL13的DNA為模板進行重復性試驗，以HL13的4個濃度為參照，重復3次qPCR，根據擴增結果的閾值循環數（Cyclethreshold， C_t 值）進行分析，并計算平均 C_t 值、標準偏差（Standard

Deviation， S_p ）和變異系數（CoefficientofVariation，C_v ），驗證此方法的重復性。

1.8 樣品實測

以表1中各地收集的有疑似癥狀的柑橘樣品和脫毒材料作為實測樣品，檢測樣品收集地的柑橘黃龍病發生情況，并驗證該方法的實用性。

2 結果與分析

2.1 特異性驗證

對表1中兩個染病樣品（HL04、HL13）、脫毒樣品、美洲種和非洲種對應基因片段的質粒以及本實驗室保留的柑橘發生的其它病害的病原菌，并以無菌水作為空白對照進行實時熒光PCR檢測，結果如圖1所示，兩個染病樣品有明顯的擴增曲線，脫毒樣品、空白對照、和其它柑橘上常見的病菌均無擴增曲線出現，在從江縣和榕江縣兩個不同地理來源的染病樣品均可以檢出；相近種如非洲種、美洲種均無法檢出，體現了該方法對柑橘黃龍病菌亞洲種的特異性檢測有良好的效果。

2.2 靈敏度測試及標準曲線的建立

選用特異性擴增明顯的染病樣品，經DNA含量測定后對其進行10倍的梯度稀釋，共7個濃度梯度，DNA濃度為 100，10，1，0.1，0.01，0.001 、0.0001ng/μL ，分別設置2個重復進行擴增，結果具有典型的擴增曲線（圖2、圖3），顯示在前5個

DNA濃度時的 C_t 值分別為21.07、24.37、28.07、32.84、35.35，在DNA濃度為 0.001ng/μL 及更低濃度時均無擴增曲線，說明本方法對柑橘黃龍病菌亞洲種的檢測限度在 0.01ng/μL 左右。

通過對所測定濃度的樣品進行實時熒光PCR檢測可知，DNA濃度與 C_t 值呈正相關關系，DNA濃度與可檢測到的熒光信號的循環數呈負相關，根據結果可繪制標準曲線 ：y=-3.7x+28（R²=0.9932） 。

2.3 重復性試驗

以HL13的DNA的4個濃度（80、8、0.8、0.08ng/μL ）進行3次重復實時熒光PCR檢測。由表2的結果可知， C_v 值在 0.12%～0.70% 之間，說明該方法對柑橘黃龍病菌亞洲種的實時熒光PCR檢測有良好的重復性和穩定性。

2.4 實際樣品檢測

對表1中由各地果園收集的17個實際樣品進行檢測。利用本研究所建立的方法，用染病樣品HLO4為陽性對照，脫毒材料HLN為陰性對照，無菌水為空白對照，進行實時熒光PCR檢測。結果（圖4）顯示樣品癥狀明顯，均檢出陽性，沒有病變癥狀的樣品也有部分檢出陽性，說明僅通過外表觀察是不準確的，體現了柑橘黃龍病的潛伏性，也體現了本方法對柑橘黃龍病檢測的實用性。

3 討論與結論

亞洲柑橘黃龍病是國內一種重要的檢疫性病害，該病害由一種韌皮部桿菌所引起的，在侵染果樹后，會導致樹葉變黃，果實小、畸形且顏色變化不佳，整體植株活力下降，從而導致植株發育不良，使其產量降低。該病菌具有一定的潛伏期，癥狀表現一般在1＼～3a之間，通常在幼樹中表現得比較快，對于樹齡長且生長狀態較好的果樹的潛伏期會更長[1]。它能侵染大部分的柑橘品種，是我國柑橘產業發展的一大阻力。每年都會造成巨大的經濟損失，自2012年以來，江西贛州等地黃龍病大面積暴發，迄今已砍除病樹超過4500萬株，預估直接經濟損失90 億元以上[12]，廣西由于黃龍病的發生，損毀柑橘果園累計超 過4萬 hm² ，造成直接或間接經濟損失超過100 億元[13]。由于該病害的病原菌屬于難純培養的細菌，癥狀比較復雜，容易與植株上其他的病害相混淆，且潛伏期較長，在植株染病后不會過快的表現，當出現癥狀時，該植株已經到了無法挽救的地步。目前，應對方法主要以培育無病苗木和加強檢疫為主，以防止其傳染與蔓延。因此對柑橘黃龍病的早期正確診斷對防治該病具有重要的意義。同時，建立新型柑橘黃龍病菌亞洲種快檢方法，能更好更快的鑒別該病害并及時處理，不僅能滿足口岸的相關鑒定，維護國內外良好的柑橘產品的流通，更對我國的柑橘產業的進一步發展有著重要的促進作用。

對于柑橘黃龍病菌亞洲種的相關研究已經持續了多年，目前已有多種檢測方法，包括常規PCR、巢式PCR、實時熒光PCR 和數字PCR 等方法[6]上述方法中，以實時熒光PCR和數字PCR的靈敏度最高，但數字PCR目前普遍應用較為困難，儀器昂貴且操作復雜[14-15]，對于大樣本檢測，實時熒光PCR具有更好的優勢。

本研究根據亞洲種核糖體蛋白基因rplj/rpll，在收集近似種的相關基因序列后，比對設計了一對特異性引物和一條TaqMan探針，建立了柑橘黃龍病菌亞洲種的實時熒光PCR方法。研究結果顯示，該方法能有效地擴增目的基因片段，特異性、穩定性和重復性均有良好的表現，實際檢測中也有很好的表現，可用于口岸對柑橘黃龍病菌亞洲種的初篩與鑒定。

（責任編輯：嚴秀芳 于慧梅）

參考文獻

[1] 范國成，劉波，吳如健，等.中國柑橘黃龍病研究30年[J].福建農業學報，2009，24（2）：183-190.

[2] BoveJM.Huanglongbing：adestructive，newly-emerging，century-olddiseaseofcitrusJ].PlantPathol，OO6，87-37.

[3] 麻玉香.柑橘黃龍病發生特點及防控措施[J].種子科技，2023，41（9）：109-111.

[4] 丁鵬.柑橘黃龍病PCR 檢測和近紅外技術快速檢測方法的建立與應用[D].贛州：贛南師范大學，2018.

[5] 李今中，王念武，周衛川，等.亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法：SN/T2071—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[6] Li W，Hartung JS，LevyL. Quantitativereal-time PCR for detectionandidentificationof Candidatus Liberibacter speciesassociatedwith citrus huanglongbing[J].Journal of Microbiol Methods，2OO6，66（1）：104-115.

[7] 胡浩，殷幼平，張利平，等.柑桔黃龍病的常規PCR及熒光定量PCR 檢測[J].中國農業科學，2006（12）：2491-2497.

[8] Zheng Z，XuM，BaoM，etal.UnusualfivecopiesanddualformsofndBin\"Candidatus Liberibacterasiaticus\"：biologicalimplications and PCR detection application[J].Scientific Reports，2O16，6：39020.

[9] 呂燕，郭立新，段維軍.基于TaqMan MGB探針的可可花瘦病菌快速檢測方法[J].植物保護，2022，48（5）：220-226.

[10] 郭立新，段麗君，王英超，等.基于 TaqMan MGB探針的葡萄莖枯病菌實時熒光PCR 檢測方法[J].植物病理學報，

2020，50（1） ：97-106.

[11] 婁兵海.柑橘黃龍病菌亞洲種全基因組測序及遺傳多樣性研究[D].重慶：西南大學，2018.

[12] 周常勇.對柑橘黃龍病防控對策的再思考[J].植物保護，2018，44（5）：30-33.

[13]張木清，楊川毓.柑橘黃龍病納米防治藥物的研發與應用[C]//2017年全國熱帶作物學術年會，南寧：廣西大學農學院，2017.[14］張子悅，紀藝，冉強，等.亞洲柑橘黃龍病的實時熒光PCR 檢測方法比較研究[J].農產品質量與安全，2021（6）：31-37.[15］唐利華，郭堂勛，李其利，等.柑橘黃龍病田間診斷與檢測技術研究進展[J].中國植保導刊，2018，38（8）：81-87.

[16]任曉鳳，張磊，林竹山，等.柑橘黃龍病菌核酸檢測技術研究進展[J].植物檢疫，2023，37（3）：6-9.

TaqMan-based Real-time Fluorescence PCR Method for the Rapid Detection of Candidatus Liberibacter Asiaticus

Yang Xiaolong ^1，2 ， Teng Shaona ^1，2 ，He Lin ^1，2 ， Zhou Ling ^1，2 ， Gao Wenna ³ ， Wang Xiqiao ⁴ ， Kong Deying ^1，2 ， Sun Tao ^1，2 * （1.Technology Centerof Chongqing Customs Technology Center， Chongqing 400020，Chongqing，China;2.National KeyLaboratoryof Species Identificationand Quality Safety Testingof Chinese Medicinal Materials，Chongqing 400020， Chongqing， China;3.Science and Technology Research Center of China Customs， Beijing 10026，Beijing，China; 4. Technology Center of Lanzhou Customs District，Lanzhou 73oO3O，Gansu，China）

Abstract：Citrus Huanglongbing isone of themost serious diseases incitrus production inChinaatpresent.In this study，a pair of specific primers and a probe were designed and synthesized acording to the conserved rplj sequence of Candidatus Liberibacter asiaticus. This method can specifically detect the pathogen C .Liberibacter asiaticus.The results of sensitivity test showed that the lowest DNA concentration was 0.01ng/μL in 20μL reaction system. This method can be used for detection and screening of suspected samples infected by C .Liberibacterasiaticus.

KeyWords：Citrus Huanglongbing；Candidatus Liberibacter asiaticus;；rapid detection； real-time fluorescence PCR