淫羊藿素骨靶向脂質(zhì)體的制備及表征研究

中圖分類(lèi)號(hào)：R944.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8751（2025）03-0187-07

Preparation and Characterization of Bone Targeting Icaritin Liposomes

Lai Jin-mei1， Zhang Shuang-qing2，LiuLi-han3 （1 ShenzhenLuohu Maternity and Child HealthcareHospital， Shenzhen 518000; 2 National Institute forNutritionand Health，Chinese Center for DiseaseControland Prevention，Beijing100050; 3 School of Pharmaceutical Sciences， Southern Medical University， Guangzhou 510515）

Abstract： ObjectiveTo prepare icaritin （ICT）-loading bone targeting liposomes and characterize in vitro properties.MethodsThe bone targeting peptide CSDsSD was synthesized by solid-phase peptide synthesis，and covalently linked to DSPE-PEG2000-MAL to obtain DSPE-PEG2000-CSDSSD.ICT liposomes were synthesized by membrane dispersionusing egg yolk lecithin，cholesterol，DSPE-PEG2oo-CSDsSD，and the ICT.The particle size and potential of ICT liposomes were measured using a Malvem instrument. The drug loading and encapsulation efficiency of ICT liposomes were analyzed using UV-Vis absorbance spectroscopy.ResultsThe ICT liposome had a hydrodynamic particle size of 225.3±1.8nm and a Zeta potential of -20.8±0.5mV. The transmission electron microscope image showed that ICT liposomes were uniformly sized spherical particles with a dry particle size of below 30nm . ICT liposomes did not significantly alter in hydrodynamic particle size or polydispersity over the course of a week， maintaining a particle size of about 225nm and a polydispersity index of less than O.26. The drug loading of ICT in ICT liposomes was 9.87% ，and the encapsulation efficiency was 68.90% .ConclusionWe have successfully prepared bone targeting liposomes with good stability， drug loading and encapsulation efficiency.

Key words： icaritin; liposomes； bone targeting; preparation; characterization

淫羊藿素（Icaritin，ICT）是小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿的活性成分淫羊藿苷的酶降解產(chǎn)物和淫羊藿黃酮類(lèi)化合物的腸道代謝物[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ICT具有廣泛的藥理作用，可用于抗骨質(zhì)疏松、抗炎[]、心血管保護(hù)治療、抗腫瘤治療[4]和免疫治療[5]等。

ICT能有效下調(diào)炎癥因子表達(dá)，維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡，通過(guò)促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，顯著恢復(fù)骨小梁量、骨小梁結(jié)構(gòu)和骨的生物力學(xué)性能，從而顯示出良好的抗骨質(zhì)疏松治療效果，因此在抗骨質(zhì)疏松治療受到廣泛關(guān)注和深入研究。目前，ICT應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松治療已經(jīng)進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。同時(shí)因ICT具有骨吸收、抑制脂肪生成和促進(jìn)骨形成的藥理作用，其在類(lèi)固醇相關(guān)骨壞死的預(yù)防治療方面也具有良好潛力[7]。

然而ICT水溶性較差，進(jìn)入體內(nèi)后半衰期較短，代謝快，生物利用度較低限制其臨床應(yīng)用[8-9]。同時(shí)由于無(wú)骨靶向性，ICT很難被輸送到骨組織和骨細(xì)胞[o]。為了提高ICT對(duì)骨質(zhì)疏松治療效果，維持有效血藥濃度，提高藥物遞送效率，增強(qiáng)對(duì)骨表面的靶向性是關(guān)鍵。基于此，設(shè)計(jì)了一種負(fù)載ICT的骨靶向脂質(zhì)體，提高ICT到達(dá)骨組織的藥物濃度，充分發(fā)揮ICT的抗骨質(zhì)疏松的治療效果。具體地，通過(guò)多肽固相合成法合成骨靶向多肽CSDSSD[]，并將CSDSSD通過(guò)共價(jià)連接在兩親性共聚物DSPE-PEG2000上得到DSPE-PEG2000-CSDSSD。然后我們將蛋黃卵磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000-CSDSSD通過(guò)薄膜分散法合成脂質(zhì)體，并負(fù)載ICT，最終成功獲得一種具有較高載藥量的骨靶向脂質(zhì)體（ICT-Liposome，圖1）。

1材料和方法

1.1材料

2-氯-三苯甲基氯樹(shù)脂（ 100～200 目，負(fù)載：0.625mmol/g） ，N-芴基-9-甲氧基基（Fmoc）保護(hù)的L-氨基酸[Fmoc-Asp（OtBu）-OH，F(xiàn)moc-Ser（Tbu）-OH，F(xiàn)moc-Cys（Trt）-OH]；N，N'-1-羥基苯并三氮唑（HOBt）和縮合劑苯并三氮唑-NNN'N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）購(gòu)于上海吉爾生化有限公司。二異丙基乙胺（DIEA）、乙二硫醇（EDT）、三氟乙酸（TFA）和2，6-二甲基吡啶購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和磷脂-聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG2000-MAL）購(gòu)買(mǎi)于西安瑞禧生物科技有限公司。二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、二氯甲烷（DCM）、鹽酸、乙醚和乙酸酐購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。哌啶購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

精密天平（SQP＼QUINTIX65-1CN，賽多利斯，德國(guó)），渦旋混合儀（SCILOGEX＼SCI-VS，賽洛捷克，美國(guó)），高功率數(shù)控超聲清洗器（KQ-400KDB，昆山舒美，中國(guó)），全自動(dòng)在線樣品純化-三重四極液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS，美國(guó)），基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（BrukerAutoflexSpeed TOF/TOF，Bruker，德國(guó)），透射電子顯微鏡（TecnaiG2F20S-Twin，F(xiàn)EI美國(guó)），冷凍干燥機(jī)（ModulyoD-230，ThermoFisher，美國(guó)），Zetasizer納米粒度電位儀（ZetasizerNanoZS，Malvern，英國(guó)），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2600，島津公司，日本），純水儀（MasterTouch-Q15，上海和泰，中國(guó)），恒溫磁力攪拌器（MS7-H550-PRO，北京大龍公司，中國(guó)）。

1.3骨靶向肽HS-CSDSSD的制備

如圖2，利用多肽固相合成法[12]制備靶向肽HS-CSDSSD：將 200mg RinkAmide-AM樹(shù)脂（0.625mmol/g） 置于多肽合成柱中，用蒸餾過(guò)的DMF溶脹30min；加入 20% 哌啶（DMF配制）通 N₂ 反應(yīng) 10min×2 次以脫除樹(shù)脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，抽濾，DMF洗滌。稱(chēng)取Fmoc-Asp（OtBu）-OH（ 153.3mg ）、HBTU（170.7mg）、HOBt（ 60.8mg ，加入DMF（1mL）和DIEA（152.8μL 溶解，將溶液加入合成柱中，通 N₂ 反應(yīng) 2.5h ，抽濾，DMF洗滌。配制封端溶液（醋酸酐、DMF和DIEA分別為 150μL ， 2.67mL 和 269μL 加入合成柱中，與樹(shù)脂上多余的氨基反應(yīng) 30min （簡(jiǎn)稱(chēng)封端），抽濾，DMF洗滌4次。同法用 20% 哌啶脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)。稱(chēng)取Fmoc-Ser（Tbu）-OH（145.8 mg）、HBTU（170.7mg）和HOBt（60.8 mg），加入DMF（1 mL）和DIEA（152.8μL 溶解，將溶液加入合成柱中，通 N₂ 反應(yīng) ³h ，抽濾，DMF洗滌。同法繼續(xù)依次接上Fmoc-Ser（Tbu）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（Tbu）-OH和Fmoc-Cys（Trt）-OH。同法用 20% 哌啶脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)和醋酸封端。最后分別DMF、甲醇和DCM洗滌，加入 95% TFA 1.5mL （TFA、EDT和超純水分別為 1425μL ， 37.5μL 和 37.5μL ），通N反應(yīng) 120min ，將產(chǎn)物從樹(shù)脂上剪切下來(lái)。抽濾，用DCM洗滌，轉(zhuǎn)移濾液至 50mL 圓底燒瓶中進(jìn)行旋蒸，除去大部分有機(jī)溶劑，直至余下 2mL 濾液后逐滴滴入大量冰乙醚中充分沉淀， 8000r/min 離心 10min ，棄去上清，再次用冰乙醚沉淀、離心，重復(fù)2次，除盡乙醚以外的其他有機(jī)溶劑。將沉淀物放入真空干燥箱干燥，獲得干燥后產(chǎn)品H，CCO-Cys-Ser-Asp-Ser-Ser-Asp-NH₂ （縮寫(xiě)為HS-CSDSSD），通過(guò)電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Rink amide-am resin 樹(shù)脂1）.脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)2）.Fmoc-Asp（OtBu）-OH， HBTU， HOBt，EA√3）封端（醋酸酐：DMF：DIEA）4）.脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)5）.Fmoc-Ser（Tbu）-OH，HBTU，HOBt，DIEA6）.脫Fmoc 保護(hù)基團(tuán)7）.Fmoc-Ser（Tbu）-OH，HBTU，HOBt，DIEA8）.脫Fmoc 保護(hù)基團(tuán)9）.Fmoc-Asp（OtBu）-0H，HBTU，HOBt， DIEA10）.脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)11）.Fmoc-Ser（Tbu）- OH，HBU，HOBt，IEA12）.脫Fmoc 保護(hù)基團(tuán)13）.Fmoc-Cys（Trt）-OH，HBTU，HOBt，IEAnos-Cys（Trt）-Ser（Tbu）-Asp（OtBu）-Ser（Tbu）-Ser（Tbu）-Asp（OtBu）-resin14）. Remove Fmoc protecting group15）.封端（醋酸酐：DMF：DIEA）V16）.TFAH2O/Thioanisole O= 95 ：2.5 ：2.5Cys-Ser-Asp-Ser-Ser-Asp（縮寫(xiě)：CSDSSD）進(jìn)行質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確證。

1.4 DSPE-PEG2000-CSDSSD的合成

DSPE-PEG2000-MAL與HS-CSDSSD以摩爾量比1：3投料，溶于添加少量堿（10摩爾等比的DIEA）的DMF（需要提前除氧），在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)合成DSPE-PEG2000-CSDSSD[13]，將反應(yīng)后溶液轉(zhuǎn)移到截留分子量為1000的纖維素透析袋中，再在純水中（先在DMF中）透析除去剩余游離多肽，凍干獲得DSPE-PEG2000-CSDSSD。使用傅里葉紅外光譜檢測(cè)儀和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

1.5ICT-Liposome的合成和表征

以膽固醇、蛋黃卵磷脂、DSPE-PEG2000-CSDSSD、DSPE-PEG2000和ICT質(zhì)量比為1.15：6.47：0.69：0.46：1投料，完全溶于乙醇，加入氯仿混合均勻，然后37 ^°C 旋蒸形成薄膜，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS， pH6.8 ， 10mmol/L 超聲水化 10min ，通過(guò)透析 除去游離藥物，最后通過(guò)離心超濾方法濃縮（ 100kDa ， 3500r/min） 。利用馬爾文電位粒徑儀測(cè)定其粒徑和電位，并測(cè)定材料在水溶液中的7d穩(wěn)定性。同時(shí)利用透射電鏡觀察ICT-Liposome的形狀和大小。

1.6紫外光譜分析ICT-Liposome載藥量和包封率

分別以 95% DMSO為溶劑，用配制好的理論濃度為 100μg/mL 的ICT母液各配制一組理論濃度為2μg/mL 、 3.125μg/mL 、 6.25μg/mL 、 10μg/mL 和12.5μg/mL 的待測(cè)液，掃描其紫外吸收曲線 （250～800 nm）。分析其紫外可見(jiàn)分光光譜，獲得ICT的最大吸收波長(zhǎng)，并擬合制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取透析前一定量的脂質(zhì)體，以 14000r/min 轉(zhuǎn)速超速離心 30min ，取5μL沉淀，用純 950μL DMSO溶解，并用 95% DMSO稀釋?zhuān)谧畲笪詹ㄩL(zhǎng)測(cè)定吸光度值。同時(shí)一定量的制備好的脂質(zhì)體冷凍干燥，稱(chēng)量約 0.5mg 的凍干樣品，95%DMSO溶解并稀釋?zhuān)谧畲笪詹ㄩL(zhǎng)測(cè)定吸光度值。按照下列計(jì)算公式得到脂質(zhì)體的載藥 （LE）和包封率（Qw）：

包封于納米粒內(nèi)的藥物質(zhì)量

LE（%）= ×100% 載藥納米粒的總質(zhì)量包封在納米粒內(nèi)的藥物質(zhì)量

Qw（%）= ×100% 藥物投料總質(zhì)量

2結(jié)果與討論

2.1骨靶向肽HS-CSDSSD的合成和表征

首先通過(guò)多肽固相合成法合成多肽HS-CSDSSD，其精確分子量為653.20，在ESI-MS負(fù)離子模式下，理論上出現(xiàn) [M-H⁺] 的準(zhǔn)分子離子峰，質(zhì)荷比為652.20。所合成的產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果如圖3，質(zhì)譜圖出現(xiàn)質(zhì)荷比為652.13的準(zhǔn)分子離子峰，符合多肽HS-CSDSSD的分子量大小，可確證多肽的結(jié)構(gòu)。

2.2 DSPE-PEG2000-CSDSSD的合成和表征

參考文獻(xiàn)的方法合成DSPE-PEG2000-CSDSSD[13]，多肽HS-CSDSSD上的巰基-SH可通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)與DSPE-PEG2000-MAL上的馬來(lái)酰亞胺共價(jià)連接。使用傅里葉紅外光譜檢測(cè)儀對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。理論上多肽HS-CSDSSD的游離巰基在 2500～2600nm 有小波峰，與其他化合物共價(jià)連接后小波峰消失。如圖4所示，HS-CSDSSD的紅外光譜圖上在 2590～2530nm 上有波峰，與DSPE-PEG2000-MAL上的馬來(lái)酰亞胺共價(jià)連接后，波峰消失，可證明DSPE-PEG2000-CSDSSD已成功合成。同時(shí)通過(guò)觀察時(shí)間飛行質(zhì)譜MALDI-TOF（圖5），DSPE-PEG2000-CSDSSD的分子量范圍 3000～4200 ，相當(dāng)于DSPE-PEG2000-MAL（ 2400～3600 增加了大約600的分子量，與HS-CSDSSD的分子量相符，進(jìn)一步確證了DSPE-PEG2000-CSDSSD的合成。

2.3ICT-Liposome的合成和體外性能表征

采用簡(jiǎn)單的薄膜分散法制備了骨靶向脂質(zhì)體ICT-Liposome。隨后，對(duì)ICT-Liposome的粒徑和形貌進(jìn)行了表征。采用馬爾文粒徑電位測(cè)量?jī)x測(cè)定

ICT-Liposome在水溶液中的流體動(dòng)力學(xué)直徑和Zeta電勢(shì)，測(cè)得ICT-Liposome的DLS粒徑為 225.3±1.8 nm[ 多分散指數(shù)（PDI）：0.216]，Zeta電位為- .20.8±0.5 mV（圖6A和B）。根據(jù)透射電子顯微鏡（TEM）結(jié)果（圖6C）顯示，ICT-Liposome為大小均一的球形顆粒，粒徑為 30nm 以下。以上結(jié)果表明ICT-Liposome具有理想的粒徑和負(fù)電性，有利于實(shí)現(xiàn)體內(nèi)被動(dòng)靶向骨組織給藥。同時(shí)，我們對(duì)ICT-Liposome的粒徑穩(wěn)定性和多分散性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。如圖6D所示，ICT-Liposome在一周內(nèi)粒徑維持在 225nm 左右，PDI保持在0.26以下，粒徑和分散度沒(méi)有明顯變化，表明ICT-Liposome具有良好的粒徑穩(wěn)定性。

2.4ICT-Liposome的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析、載藥率和包封率的測(cè)定

首先通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)獲得ICT的紫外-可見(jiàn)光譜圖（圖7），發(fā)現(xiàn)ICT的紫外最佳吸收波長(zhǎng)為274nm 。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同的濃度的ICT在 274nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合曲線公：DSPE-PEG200-CSDSSD的MALDI-TOF圖；B：DSPE-PEG200-MAL和DSPE-PEG2000-CSDSSD的MALDI-TOI式為 C=0.06945A-0.00613（R^z=0.998） ，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中根據(jù)載藥量計(jì)算公式計(jì)算得ICT-Liposome中ICT的載藥率為 9.87% ，包封率為 68.90% 。

3結(jié)論

通過(guò)多肽固相合成法成功制備了骨靶向肽CSDSSD，并通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)將多肽CSDSSD連接在DSPE-PEG2000上合成DSPE-PEG2000-CSDSSD 。利用蛋黃卵磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000-CSDSSD三種原料通過(guò)薄膜分散法制備脂質(zhì)體，并負(fù)載ICT，最終獲得ICT-Liposome。ICT-Liposome具有理想的粒徑和電位，大小均一，粒徑穩(wěn)定性良好，同時(shí)載藥量和包封率高。本研究設(shè)計(jì)合成的ICT-Liposome為實(shí)現(xiàn)ICT高效靶向骨組織，提高ICT到達(dá)骨組織的藥物濃度，充分發(fā)揮ICT的抗骨質(zhì)疏松的治療效果提供一種新策略。

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