ROS響應型水凝膠的制備及其抗菌性能研究

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8751（2025）03-0194-10

Study on the Preparation and Antibacterial Properties of ROS-Responsive Hydrogels

.ong Zi-linl，Wang Zi-qi'，MaJunl，Huang Xiao-jing2，LeiLei2，GuHuan’， Zeng Ruil.3，Gou Kai-jun34 （1 The College of Pharmacy and Food Science of The Southwest Minzu University， Chengdu 610041; 2Chengdu Institutefor DrugControlamp;NMPAKeyLaboratoryforQualityMonitoringandEvaluationof Traditional Chinese Medicine （Chinese Materia Medica）， Chengdu 610000; 3 Key Laboratory of Research and Application of Ethnic Medicine Processng and Preparation on the Qinghai Tibet Plateau， Southwest Minzu University，Chengdu 610225; 4 College of Grassland Resources， Southwest Minzu University， Chengdu 610225）

Abstract： ObjectiveTo screen the optimal ratio of the PVA/BSP hydrogel matrix to prepare rifampicin loaded ROS-responsive hydrogel，improve the bioavailabilityofrifampicin，evaluate itsROS-responsive drug release and antibacterial efect，and provide a new optionfor bacterial infected wounds.MethodsTheappropriateconcentration ratio of PVA/BSP hydrogel matrix was screenedand optimized，and the ROS-responsive hydrogel was prepared by loadingrifampicin.TheROS-responsive drug release characteristicsof the hydrogel were measured by ultraviolet spectrophotometer，and its antibacterial property was further evaluated in vitro.ResultsThe optimal PVA/BSP ratio was 2：3 （ 8%PVA ， 12%BSP ）.The adhesion strength of the rifampicin-loaded hydrogel was 56.83KPa at a 15 mm stretch distance，and the highest compressive strength was 96.42 781 KPa.Compared with the PBS-released group， the rifampicin hydrogel showed a higher cumulative drug release in the H₂O₂ -PBS solution，and the rifampicin release rate at 48h （92.86%） ）Was significantly higher than that in the PBS-released group （47.53%） .Invitro antibacterialtestresultsshowed thatthe inhibition Zoneof the hydrogel to methicilin-resistant Staphylococcus aureus， Staphylococcus aureus， and Escherichia coli was 3.4±0.10cm ， 1.75±0.05 cm and 1.8±0.01cm ，respectively. ConclusionRifampicinhydrogel has goodbiodegradability，tisueadhesion，mechanical properties，ROS-responsive drug release ability，and goodantibacterial properties.Therefore，rifampicin hydrogel has a broad applicationprospect in the antibacterial and repair of bacterial infection wounds.

Key words： ROS response；rifampicin；hydrogel; in vitro release；antibacterial

皮膚將人體的內部環境與外部環境分開，作為人體的天然屏障在防御外界的傷害中起著至關重要的作用[1-2]。然而，由于外部因素（手術、壓力、燒傷和割傷等）和病理因素（糖尿病或血管疾病等）很容易導致皮膚受傷[3]，這會導致皮膚保護屏障出現缺口，感染細菌等病原體，進而傷口感染加重難以治愈。當傷口形成后，局部募集的炎癥細胞可能立即遷移到傷口部位，使傷口修復進入炎性期[4]。一方面，細菌感染會加劇炎癥[5]，導致活性氧（ROS）過度沉積，加速成纖維細胞老化，阻礙血管生成和上皮細胞再生，并破壞自然愈合[6-7]。另一方面，細菌感染可能導致免疫細胞受損，使其難以逆轉病理變化，延長炎癥期并阻礙傷口進一步修復[8-9]，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）存在于 7%～30% 的傷口中，且MRSA可能會擴散到血液中（誘發傷口感染概率較大）[10]，并向周圍組織蔓延，引起蜂窩織炎和膿腫等并發癥，進一步導致傷口難愈合、疤痕形成和功能障礙等并發癥，嚴重者具有組織壞死甚至危及患者生命的風險[]，增加治療的復雜性[12-13]。因此，借助傷口部位的ROS或炎癥微環境，正確合理地控制細菌對傷口的感染，對促進傷口后續的有序修復和加速愈合具有至關重要的意義[14-15]。

目前，治療細菌感染傷口的策略有很多，如抗生素、噬菌體和納米材料的復合物等多種化合物[16-17]，其中抗生素最為常用，但其劑量的不合理使用逐漸降低了抗生素的治療效果，甚至形成了抗生素耐藥性[18]。利福平是廣譜性殺菌抗生素的代表藥物之一，具有極強的抗葡萄球菌活性，可治療多重耐藥葡葡球菌所致重癥化膿-膿毒性疾病（膿毒性關節炎和膿毒癥等）[19]，或與其他抗生素聯用治療金黃色葡萄球菌引起的菌血癥和心內膜炎[20]。臨床研究表明，利福平對革蘭陰性菌及陽性菌均有很好的抗菌作用，用利福平涂抹在無菌紗布外敷于燒傷創面，可起到抗菌和殺菌的作用，提高細菌清除率[21]。然而，利福平在傳統用藥中還存在半衰期短、不良反應大、難溶解（導致生物利用度低）以及成本昂貴等局限[22]，故提升利福平的生物利用度，并實現其控制釋放是治療傷口細菌感染的關鍵[23-25]。目前，在醫用傷口敷料（紗布、黏性繃帶、泡沫和水凝膠等）中，水凝膠因具有保濕、自愈和按需功能設計特點，可用作抗生素緩控釋的良好遞藥平臺，在治療皮膚傷口感染方面具有巨大潛力[26-28]。因此，以水凝膠基質為載體，設計和開發一種基于傷口部位的微環境響應控制釋放利福平水凝膠遞送平臺，對于有效治療細菌感染傷口具有重要研究意義。

白及[Bletillastriata（Thunb.）Reichb.f.]是一種傳統的中草藥，其藥用部位為塊莖，在中國被廣泛用作止血草藥。根據《中華人民共和國藥典（2020年版）》標準，白及具有收斂、止血、消腫和增肌等功能。白及多糖（BletillaStriatapolysaccharide，BSP）為白及的主要活性成分[29]，在傷口愈合方面具有“藥輔合一”的獨特優勢：一方面BSP具有良好的膨脹性能、水蒸氣透過性能、高保濕和高黏度性能（可提供創面濕性愈合環境，且能避免外部細菌的感染）[30]；另一方面BSP具有促進傷口愈合的治療效果[31]。BSP是近年來創面愈合修復相關領域的研究熱點，有關BSP的“藥輔合一”特性及創面愈合方面已有大量研究，尤其是以BSP作為傷口敷料（如水凝膠、止血海綿及微針等）的各種劑型研究[32-41]，已證實BSP具有良好的生物相容性和黏附成膜特性，且具有促進凝血、抗炎、抗氧化、黏膜保護和傷口修復等藥理作用，對于表皮生長因子（EGF）和表皮生長因子受體（EGFR）的表達也具有促進作用，并且能夠通過調節JAK/STAT信號通路中Janus激酶2（JAK2）的表達水平來抑制炎癥因子的釋放[37，39，42-44]，因此特別適合構建創面修復遞藥系統。最新的研究指出[43]，使用BSP作為還原劑和穩定劑，制備載納米銀的凝膠，并對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌表現出良好的抗菌能力。

故在本研究中，通過4-（溴甲基）苯基硼酸（4-PBA）和聚乙烯醇（PVA）之間苯硼酸酯交聯，制備負載抗生素利福平的ROS響應性水凝膠，以治療細菌感染的傷口愈合。在該水凝膠中，4-PBA和PVA形成的苯硼酸酯鍵具有ROS響應性，可以實現藥物的響應性釋放。利福平為難溶性藥物，負載到水凝膠中可以使藥物更好地遞送到傷口處，提高藥物溶解度和生物利用度。因此，本研究測試了水凝膠的機械性能、黏附性能、響應性、降解、釋放和抗菌性能等，通過設計的水凝膠提升利福平抗菌特性，并在ROS反應條件下表現出持續釋放，實現抗菌藥物在ROS響應型水凝膠上的遞送，用于修復細菌感染型的皮膚傷口。

1材料和儀器

利福平（成都艾博克生物科技有限公司）；白及（四川省中藥材飲片有限公司）；聚乙烯醇1799（PVA，成都市科隆化學品有限公司）；4-溴甲基苯硼酸（上海泰坦科技股份有限公司）；四氫呋喃（成都市高新區蔚藍化學試劑經營部）；N，N， ΔN^′ ，N'-四甲基-1，3-丙二胺（上海泰坦科技股份有限公司）；N，N'-二甲基甲酰胺（DMF，上海泰坦科技股份有限公司）；酵母浸出粉（英國Oxoid生物公司）；蛋白膝（上海金畔生物科技有限公司）；氯化鈉（上海泰坦科技股份有限公司）；瓊脂（科密歐試劑），PBS7.4（上海泰坦科技股份有限公司）；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC43300，京保生物科技有限公司）；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌（ATCC25922、ATCC6538，上海魯微科技有限公司）；旋轉蒸發儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；多功能粉碎機（武義海納電器有限公司）；98-2磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；低速離心機（常州金壇良友儀器有限公司）；Milli-Q凈水系統（Millipore，Bedford，MA，USA）；ESJ200-4萬分之一電子天平（沈陽市龍騰電子有限公司）；BT25S十萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州予創儀器設備有限公司）；YTLG-10A真空冷凍干燥機（上海葉拓科技有限公司）；CHA-AB雙功能氣浴恒溫振蕩器（常州市金壇區指前鎮旭日實驗儀器廠）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海恒一科技有限公司）；UV2400紫外分光光度儀（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；質構儀（上海騰拔儀器科技有限公司）。

2方法

2.1ROS響應性交聯劑（TSPBA）的合成

將4-（溴甲基）苯基硼酸（4-BPA）（lg，4.6 mmoL）和N，N， N^′ ， ΔN^′ -四甲基-1，3-丙二胺（TMDAP）0 0.2g ， 1.5mmoL 溶解于 ΔN ， ΔN^′ -二甲基甲酰胺（DMF， 40mL 中，并將溶液在 60^°C 下攪拌 24h 。然后將混合物倒入四氫呋喃（THF， 100mL 中，過濾，并用THF 3×20mL 洗滌。在真空下干燥過夜后，獲得純TSPBA。

2.2負載利福平的ROS響應型水凝膠最優比例篩選

2.2.1ROS響應型水凝膠的制備

將聚乙烯醇1799（PVA）溶解在去離子（DI）水中以獲得 10wt% 澄清PVA溶液。通過將PVA和TSPBA（在H，O中5 wt% ）以3：1的比例混合在一起立即形成空白水凝膠。將BSP按最優篩選比例將BSP與PVA混合均勻，獲得一定濃度的BSP與PVA混合溶液（B-P溶液）。將利福平在TSPBA溶液中混合均勻，獲得50wt% 的利福平與TSPBA混合溶液（L-T溶液）。通過將B-P溶液和L-T溶液（在HO中5 wt% 以3：1的比例混合在一起立即形成水凝膠。

2.2.2不同濃度BSP和PVA水凝膠初步篩選

稱取適量的BSP和PVA，以去離子水為溶劑配成溶液，以一定濃度的PVA與BSP混合，形成以下比例的水凝膠： 6%PVA/4%BSP 、 8%BSP 、 12% BSP或 16%BSP ； 8%PVA/4%BSP 、 8%BSP 、 12%BSP 或16%BSP ； 10%PVA/4%BSP 、 8%BSP 、 12% BSP或16%BSP 的濃度，分別以表1中制備難易程度、機械性能和氣泡程度等為考察指標，制備三組以上利福平水凝膠進行綜合評分，取平均值，以初步篩選BSP/PVA水凝膠的最佳濃度比例。

2.2.3利福平水凝膠PVA/BSP最優比例篩選

根據2.2.2方法篩選出的結果，選定適宜濃度的PVA，制備BSP濃度為 4% 、 8% 、 12% 和 16% 的水凝膠，置于 37°C 恒溫搖床中， 200r/min 振蕩 ^48h ，定時取出稱量水凝膠重量，通過觀察以上不同濃度利福平水凝膠在不同環境下[以PBS或是含有 H₂O₂ 的PH為7.4的PBS -PBS）為介質]的降解，以降解能力評估水凝膠ROS響應性能力。篩選ROS響應性好的BSP濃度水凝膠。在此基礎上，以此BSP濃度為標準，制備PVA濃度為 6% 、 8% 和 10% 的水凝膠，按上述的方案考察水凝膠的ROS響應性能。

2.3利福平水凝膠的機械性能研究

水凝膠的機械性能通過抗壓強度試驗評估。首先將水凝膠塑造成直徑為 5mm 、高度為6mm的圓柱體。隨后，使用直徑為 5mm 探頭的質構儀以 1mm/ min的速度進行測試，并記錄水凝膠的應力-應變數據，每個樣品組重復實驗3次。

2.4利福平水凝膠的組織黏附性能研究

水凝膠的組織黏附性能通過搭接剪切試驗評估。簡單地說，將新鮮豬皮切成矩形 （50×10mm²） 并置于蒸餾水中。隨后，按照2.2方法制備利福平水凝膠。將利福平水凝膠轉移到豬皮膚的皮下組織，并將其涂抹均勻（涂抹面積為 125×10mm² 。使用濾紙除去過量的表面水，將另一張豬皮貼在水凝膠上，并使用200g的重量壓制黏合 30min 。然后，使用質構儀進行測量，拉伸速率為 ρ.2mm/s 。并記錄水凝膠的黏附數據，每個樣品組平行重復實驗3次。

2.5利福平水凝膠體外釋藥試驗

2.5.1標準液的配制及標準曲線的繪制

標準液的配制：精密稱取 5mg 利福平對照品至5mL量瓶中，用乙醇溶解并定容得到濃度為 1mg/mL 的利福平乙醇液。按比例稀釋得到 1.0mg/mL 、 0.5mg/ mL、 0.25mg/mL 、 0.125mg/mL 和 0.0625mg/mL 系列標準溶液，以乙醇為空白對照，在 338nm 波長處測定上述標準溶液的吸光度（A）值，繪制標準曲線。

2.5.2利福平水凝膠的體外釋放曲線

通過振蕩器在 37^°C 下分別在 12mL PBS溶液（NaCl137mmolL ，KCl2.7mmol/L， Na₂HPO₄ 10 mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，pH7.4）中以及 H₂O₂ -PBS溶液中孵育水凝膠，并進行分組評價。在預定的時間點取樣2mL，并用新鮮的PBS以及 H₂O₂ -PBS溶液補足 （2mL） 原孵育液，通過紫外可見分光光度計，以乙醇為空白對照，在 338nm 波長處測定釋放液中利福平的濃度。

2.6利福平水凝膠體外抑菌實驗

菌液培養：取 10mL 液體培養基至滅菌試管中，吸取 10μL 菌液加至試管中，于 、 200r/min 搖床中培養過夜；固體培養基的配制：2.5g胰蛋白陳、1.25g酵母提取物、2.5g氯化鈉、3.725g瓊脂，加水至250mL， 120°C 高壓滅菌。將利福平藥物及水凝膠樣品置于無菌環境中，并在紫外光下滅菌 30min ，以避免樣品表面染菌。將 60μL10⁶CFU/mL 菌液涂布于固體培養基，待菌液完全風干后，培養基中打孔（直徑為0.7mm），最后將藥物（ 0.2mg 、材料組水凝膠和利福平水凝膠（含藥物 0.2mg 分別放置于培養基的中間孔洞中，37^°C 培養箱孵育12h后，觀察并對細菌進行計數。

3結果

3.1ROS響應型材料TSPBA的制備由核磁共振氫譜（圖1）可以看出， ¹H NMR（600MHz， D₂O 87.86 （d， J=7.7Hz ，4H），7.59 （d， J= 7.7Hz ，4H），4.62 （s，4H），3.51-3.34 （m，4H），3.15（s，12H），2.53-2.45（m，2H）。對比參考TSPBA合成文獻[45]，可證明響應性材料TSPBA合成成功，獲得TSPBA（ 0.65g ，產率 75.83% ）

3.2不同濃度BSP和PVA水凝膠篩選

由表2中數據可以看出，BSP及PVA濃度越高，水凝膠完整度和機械性能越好。根據評分，綜合機械性能、制備難易程度和氣泡程度，初步篩選評分為22分以上的幾組樣品：（1）在PVA濃度 8% 時，BSP濃度 12% ；（2）在PVA濃度 8% 時，BSP濃度 16% ； （3）在PVA濃度 10% 時，BSP濃度 8% ；（4）在PVA濃度 10% 時，BSP濃度 12% ；（5）在PVA濃度 10% 時，BSP濃度16% ，并對這幾組通過響應性降解觀察，重復制備利福平水凝膠，進行進一步優化，確定BSP和PVA的最優濃度比例。

3.3觀察不同濃度BSP和PVA對水凝膠響應性的影響

3.3.1 8% 的PVA濃度下不同BSP濃度對水凝膠的影響

在PBS和 H₂O₂ -PBS溶液中，通過響應型降解實驗觀察PVA濃度為 8% ，BSP濃度為 4% 、 8% 、 12% 和16% 的水凝膠對 ?H₂O₂ 的響應性影響。

由圖2可以看出，當PVA濃度為 8% 時， 4%BSP 濃度組降解較快，進一步驗證了上述評分標準的可行性， 8% 和 12% BSP濃度組ROS響應性能良好，16% BSP濃度組ROS響應性較弱。

3.3.2 10% 的PVA濃度下不同BSP濃度對水凝膠的影響

在PBS和 H₂O₂ -PBS溶液中，通過響應型降解實驗觀察PVA濃度為 10% ，BSP濃度為 4% 、 8% 、 12% 和 16% 的水凝膠對 ?H₂O₂ 的響應性的影響。

結合圖2和圖3可以看出，無論PVA濃度是 8% 還是 10% ，隨BSP濃度增大，在PBS溶液中水凝膠溶脹率變大，且對水凝膠響應性有影響；在BSP濃度為 4% 時，水凝膠降解較快；在BSP濃度為 8% 和 12% 時，水凝膠對 響應能力增強且水凝膠響應性變化不大，12%BSP 濃度的水凝膠響應性略優于 8%BSP 濃度組；在BSP濃度為 16% 時，水凝膠響應性明顯變弱。

3.3.3 12% 的BSP濃度下不同PVA濃度對水凝膠響應性的影響

在PBS和 H₂O₂ -PBS溶液中，通過降解觀察BSP濃度為 12% ，PVA濃度為 6% 、 8% 和 10% 對水凝膠響應性的影響。

由圖4中可以看出，濃度為 8% 的PVA與 10% 的PVA對水凝膠ROS響應性影響不大，考慮制備難易程度以及水凝膠傷口保濕性能等因素影響，故選擇 8%PVA 和 12% BSP的比例為水凝膠最優濃度比例。

3.4水凝膠的機械強度

使用質構儀測定利福平水凝膠的抗壓強度（圖5）。利福平水凝膠的抗壓強度最高為96.42781KPa，證明該水凝膠具有很好的抗壓性能，水凝膠的機械性能通過抗壓強度試驗評估，進一步證實了該水凝膠是苯硼酸酯鍵網絡交聯的水凝膠，機械性能良好。

3.5水凝膠黏附性能測試

實驗結果如圖6所示，利福平水凝膠在 15mm 拉伸距離的黏附強度為 56.83Kpa ，可以很好地與組織黏附，結合黏性水凝膠敷料還能防止傷口感染、方便密封皮膚傷口和改善愈合微環境。

3.6 標準曲線的繪制

圖7表明，利福平的濃度在 0.625^-10 μg/mL時有很好的線性關系，其線性方程為y =0.039x+0.0076 ， R² =0.9991 。

3.7利福平水凝膠的體外釋放曲線

為了研究細菌感染環境中利福平的釋放速度以及利福平水凝膠的ROS響應性能，本次實驗分別測量了利福平水凝膠在PBS溶液和 H₂O₂ -PBS溶液中的體外釋放速度。圖8表明，在 48h 內，每個時間點的PBS組利福平累積釋放率均顯著小于 H₂O₂ -PBS組，在48h時，H₂O₂ -PBS組利福平的釋放率高達 92.86% ，而PBS組利福平水凝膠釋放率為 47.53% 。因此，利福平在模擬傷口環境的HO-PBS組中釋放48h內總釋放量最大，且利福平水凝膠的ROS響應性能良好。

3.8利福平水凝膠體外抑菌實驗

圖9表明，與水凝膠組（其抑菌圈為 1.65±0.15 cm）相比，利福平水凝膠組對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌圈為 3.5±0.1cm ；與水凝膠組（其抑菌圈為0.95±0.05cm 相比，利福平水凝膠組對金黃色葡萄球菌抑菌圈為 1.75±0.05cm ；與水凝膠組（其抑菌圈1.15±0.05cm 相比，利福平水凝膠組對大腸埃希菌的抑菌圈為 1.8±0.01cm 。由上述三種細菌的抗菌實驗可以著出，利福平水凝膠組對多種細菌抑菌效果明顯，但由于固體培養基中未加入 H₂O₂"，無法模擬細菌感染的傷口環境，所以利福平水凝膠組抑菌圈均小于藥物組。

4結論與展望

4.1結論

本研究首次基于苯硼酸酯的動態鍵構建了具有ROS響應性能的載利福平的抗菌水凝膠敷料，用于修復細菌感染的皮膚傷口。核磁共振氫譜證明ROS響應性交聯劑TSPBA的成功合成，響應性降解實驗篩選得到載利福平水凝膠的PVA/BSP最佳比例為2：3（8%PVA 和 12%BSP_. ，理化表征實驗證明利福平水凝膠具有良好的黏附性能以及機械強度（在 15mm 拉伸距離的黏附強度為 56.83Kpa ，抗壓強度最高為 96.42 781kPa ，體外釋藥實驗證明利福平水凝膠具有良好的ROS響應性能[在48h的利福平釋放率（204號 （92.86% 顯著高于PBS釋藥組 （47.53%） ，可以快速發揮抗菌作用]，體外抑菌實驗證明利福平水凝膠對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌以及大腸埃希菌的抗菌效果良好（對以上三種菌的抑菌圈分別依次為 3.5±0.1cm 、 1.75±0.05cm 和1.8±0.01cm ，均顯著高于水凝膠組）。綜上所述，ROS響應型利福平水凝膠對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均有抑菌作用，并具有良好的黏附性能、機械性能以及ROS響應性能，表明ROS響應型利福平水凝膠有望成為有效治療細菌感染傷口的新型敷料。

4.2展望與挑戰

本研究制備的ROS響應型利福平水凝膠在促進細菌感染傷口愈合過程中具有一定潛力，后續將進一步研究，如水凝膠內部網絡結構（SEM）、水凝膠流變性能、血液相容性、細胞毒性、細胞黏附性以及大鼠體內傷口愈合實驗評估該敷料對細菌性感染傷口的愈合能力、病理組織學、免疫組織學評價以及炎癥因子表達水平等方面的試驗研究。從而驗證水凝膠的孔隙結構是否可以提高滲透性進而促進傷口愈合，且由于傷口愈合過程較復雜，應對一些炎癥因子表達水平進行研究，進而深入探討該敷料治療細菌性感染傷口藥效和作用機制，為了更好地發揮其促進細菌性感染傷口愈合的能力，考慮將水凝膠傷口敷料與其他治療方法（細胞療法和基因療法）相結合，達到相輔相成的作用，以進一步實現高效和全面的傷口治療，為開發治療細菌感染全方位傷口愈合的材料的臨床轉化奠定基礎。

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