基于cAMP/cGMP、AQP4探究綜合性虛損癥模型的建立

吳雅晨，唐冰雪，段麗，胡萬福，張永萍，劉明，3*

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002;3.貴州中醫藥大學 中藥、民族藥藥理作用及作用機制研究中心，貴州 貴陽 550025)

虛損癥是各臟腑虛衰導致的慢性疾病，臨床多表現為神疲乏力、面色萎黃、惡寒肢冷、眩暈耳鳴，與現代醫學中的亞健康有緊密的聯系。中醫學認為，虛損為人體正氣不足、氣血津液虧虛所致，治療則以扶正固本，使機體恢復正常的生理機能。鑒于目前臨床上虛損癥患者逐漸增加，但因個體的社會影響及倫理等方面很大程度上限制了虛損癥內在作用機制的相關研究。因此要探尋傳統醫學通過扶正固本治療虛證的科學內涵，借助動物模型來觀察虛損癥的現代實質。氣虛、血虛、陰虛、陽虛是中醫學虛證的幾種證型，在前期科研人員也對氣虛動物模型(如利用煙熏、瀉下、勞累、饑餓、失血等形式復制)，血虛動物模型(如利用失血、溶血、化學損傷、輻射損傷等形式復制)，陽虛動物模型(如利用腎上腺皮質激素類藥、雌激素、嘌呤類藥、游泳、飲食失調、瀉下等形式復制)，陰虛動物模型(如利用利血平、糖皮質激素、甲狀腺激素、飲食不節、疲勞等形式復制)進行了探索[1-2]。但任何一種虛證模型都有各自的特征，且在日常飲食、生活環境等因素的疊加作用下患者往往呈現出氣血陰陽俱虛的生理狀態，故而在臨床上單純性的虛損癥并不常見。因此，本研究基于以往綜合性虛損證造模法的研究進展，進一步設計了動物實驗并觀察不同組別中環磷酸腺苷(cAMP)/環磷酸鳥苷(cGMP)、水通道蛋白4(AQP4)變化，以期實驗模型更加貼切臨床虛損癥病人的各項生理狀態。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM雄性成年小鼠36只，6～8周齡，體質量18～22 g，小鼠購自重慶騰鑫生物科技有限公司，合格證號：SCXK(軍)2012-0011。實驗經貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，批號：17009018。小鼠購入后適應性喂養3 d，整個實驗期間均在室溫22～24 ℃，相對濕度55%～65%環境下，自然光照、自由飲水飼養。

1.2 主要試劑與儀器

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、環磷酸鳥苷(cyclic guanine monophosphate，cGMP)試劑盒購于深圳子科生物科技有限公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)抗體購于Abcam公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；MinuteTM動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒，購于北京英文特生物技術有限公司；微量BCA蛋白定量試劑盒，購于北京康為世紀生物科技有限公司；PVDF膜，購于Millipore公司。小鼠自主活動儀購于成都泰盟科技有限公司；酶標儀購于美國BIO-RAD公司；電泳儀和凝膠成像系統購于美國BIO-RAD公司；電子顯微鏡購于日本奧林巴斯株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模

根據體質量將36只KM小鼠隨機分成正常對照組、模型組A、模型組B，每組12只。中途如有動物死亡，則同步補充，保證每組12只動物。

模型組A：小鼠灌胃30%番瀉葉水浸液10 mL/kg及游泳15 min(水溫23～25 ℃)，連續3周，每周6 d，每天1次。并于造模第1天時，小鼠一次性尾尖放血0.3 mL。

模型組B：小鼠灌胃40%番瀉葉水浸液10 mL/kg及游泳25 min(水溫23～25 ℃)，連續3周，每周6 d，每天1次。并于造模第1天時，小鼠一次性尾尖放血0.4 mL。

1.3.2 體征檢測

每周第7天時觀察小鼠外觀狀態，記錄體質量，測量體溫、自主活動及游泳力竭時間(記錄小鼠入水至力竭的時間。力竭標準為：水溫23～25 ℃，小鼠鼻部在水面上下浮動，最終至頭浸入水面以下5 s未能浮上來視作力竭，將小鼠撈出，擦干水，繼續飼養)。

1.3.3 血漿cAMP、cGMP檢測

末次體征檢測結束后，麻醉小鼠，股靜脈取血，按照試劑盒說明書操作檢測血漿cAMP、cGMP含量。

1.3.4 臟器指數測定

小鼠取材，分別取出肝、心、脾、肺、腎、胸腺，稱重，計算臟器指數。

1.3.5 Western blot檢測腎臟AQP4蛋白

取腎臟，根據試劑盒說明，腎臟總蛋白提取后，BCA法蛋白定量。按試劑盒操作步驟制備濃度12%分離膠和濃度5%濃縮膠，80 V電壓電泳2 h后60 V電壓轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗，β-actinⅠ抗濃度1∶6 000、AQP4Ⅰ抗1∶500，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜后加入Ⅱ抗1∶10 000，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL顯影液顯影，Image J計算灰度值，進行比較。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 對體質量的影響

正常對照組小鼠體質量穩步增長，模型組小鼠體質量增長緩慢，造模2、3周時，模型組A、B小鼠體質量均明顯低于正常對照組(P<0.01)，但模型組A、B之間無顯著差異，見表1。

表1 各組小鼠體質量測試結果

2.2 對自主活動的影響

正常對照組小鼠身形勻稱，活動自如，對外界刺激反應正常，皮毛濃密、色乳白有光澤，飲食、二便均正常。模型組小鼠造模1周后開始出現皮毛稀疏且暗淡無光澤，飲食減少，鼠尾冰冷，活動減少。造模2、3周時，模型組A、B小鼠自主活動次數顯著低于正常對照組(P<0.01，P<0.05)，但模型組A、B之間無明顯差異，見表2。

表2 各組小鼠自主活動測試結果次，n=12)

2.3 對體溫的影響

正常對照組小鼠體溫正常，模型組小鼠體溫有所降低。造模1周后，模型組B小鼠體溫明顯低于正常對照組(P<0.05)；造模2、3周時，模型組A、B小鼠體溫均顯著低于正常對照組(P<0.01)；且在造模3周時，模型組B明顯低于模型組A(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠體溫測試結果

2.4 對游泳力竭時間的影響

正常對照組小鼠游泳力竭時間比較恒定在60 min左右，模型組小鼠游泳力竭時間明顯縮短，造模1、2、3周時，模型組A、B小鼠游泳力竭時間均明顯低于正常對照組(P<0.01)，但模型組A、B之間無顯著差異，見表4。

表4 各組小鼠游泳力竭時間測試結果

2.5 對臟器指數的影響

正常對照組小鼠臟器指數正常，模型組小鼠肝、脾、腎有所增大，胸腺萎縮。其中，模型組B小鼠的肝臟指數、脾臟指數、腎臟指數明顯高于正常對照組(P<0.05)，見表5。

表5 各組小鼠臟器指數測試結果

2.6 對血漿cAMP、cGMP含量的影響

正常對照組小鼠血漿cAMP/cGMP比值為0.38，模型組A、B小鼠血漿cAMP、cGMP含量均顯著高于正常對照組(P<0.01,P<0.05)，但模型組A、B之間無明顯差異，見表6。

表6 各組小鼠血漿cAMP、cGMP測試結果

2.7 對腎臟組織AQP4蛋白表達的影響

模型組A、B小鼠腎臟組織中AQP4蛋白表達明顯低于正常對照組(P<0.01)，見表7、圖1。

表7 各組小鼠腎臟組織AQP4蛋白測試結果

圖1 各組小鼠腎臟組織AQP4蛋白條帶

3 討論

規范化、標準化的建立動物模型是現代科學研究中醫藥成果的基本條件。氣虛、血虛、陰虛、陽虛是傳統醫學對虛損證劃分的不同證型，在中醫學的基礎研究中，動物模型也應有相應造模手段與之對應。以往的單純性虛損癥造模方法雖各有特點，但也有很多共同之處，因此，本研究從中選擇在各類虛證造模中使用頻繁的、重復性高的、容易操作的造模方法，混合在一起建立一種包羅氣虛、血虛、陰虛、陽虛的虛證動物模型，模擬臨床虛損證病人的生理病理狀態，力求所造之模型的各項指征更加挈合臨床中虛損患者的生理狀態。

在已有的氣虛動物模型方法中，瀉下、勞累及放血法有較多的應用[3-4]，血虛動物模型主要以失血法為主[5]，陽虛動物模型也多見瀉下與勞累結合[6]，陰虛動物模型也見勞累法[7]。因單一性虛損癥與綜合性虛損癥模型的實驗目的相反，前者是在單一虛損中縱向深入，所造之模型程度重，而后者是在綜合性虛損中廣泛覆蓋，所造之模型程度輕。因此，本研究從中選擇瀉下法、游泳勞累法、放血法并依據以往方式的中等程度進行混合造模，復制虛證小鼠模型。

cAMP與cGMP在細胞功能、代謝、信息傳遞中發揮了重要作用，且在正常的機體內多呈現相互拮抗、最終導致動態平衡狀態的生理狀態[8]。這與中醫理論中的陰陽理論密切相關，甚至有不少學者將cAMP與cGMP作為陰陽的物質基礎[9]，而AQP家族是大量遍布于肺、腸、胃等器官的重要蛋白，特別是AQP4對各個器官中水的運化及機體內血液的盛衰有密切聯系[10-11]，因此目前常用cAMP和cGMP含量及AQP4蛋白表達觀察模型中陰陽氣血的變化。結合文獻資料[12]選擇從外觀行為、體質量、體溫、自主活動、游泳力竭時間等指標觀察虛證小鼠的體征，并測定主要臟器指數、血漿cAMP與cGMP含量及腎臟AQP4蛋白表達，深入評價虛證小鼠的特征變化情況。

結果，通過連續3周的造模，模型組A、模型組B均出現顯著的虛證表現：小鼠皮毛稀少疏落且暗淡沒有光澤，食欲欠佳，鼠尾冰冷，運動量下降，有稀便；體質量雖有所增長，但明顯受到抑制；體溫明顯降低；自主活動顯著減少，小鼠蜷縮不喜活動；游泳力竭的時長明顯縮短，小鼠抗應激能力降低，處于疲憊狀態。臟器指數顯示，除心、肺正常外，胸腺指數降低，雖沒有顯著性，但也表明小鼠的免疫功能下降；肝、脾、腎指數增加，出現對應的氣虛、血虛證變化。血漿cAMP、cGMP含量均明顯升高，表明陰虛證和陽虛證均出現[13-14]。小鼠腎臟組織中AQP4蛋白表達顯著降低，這和虛證動物相關的實驗研究報道一致[15-16]。在3周的造模過程中，造模1周時上述的虛證動物體征表現不明顯，隨著造模時間的延長，虛損證動物體征表現越來越明顯。造模2周時，可出現明顯的虛證體征表現，故可確定造模2周可復制出成功的虛證動物模型。

模型組A與模型組B的造模方法一樣，不同在于所使用的番瀉葉水浸液的濃度、游泳時間和放血量的不同。結果也基本相同,都是在造模2周后成功復制虛證動物模型，略有不同在于模型組B的損傷程度更為嚴重。

模型組A、模型組B均成功構建了混合型的虛損證小鼠模型，且模型鼠的各項體征及AQP4等指標的變化均與對照有顯著的差異，能較大程度上反應出虛損癥患者的各種異常的生理狀態。后續課題組將持續關注國內外中醫證候本質相關課題的研究進展，并結合相關的動物及細胞實驗對本模型作持續性的改進與完善，力求為從事虛損癥的研究人員提供新的思路與方法。