CORO1A在骨肉瘤抗腫瘤免疫及預(yù)后中的作用

[摘" "要]" "目的：尋找骨肉瘤抗腫瘤免疫及預(yù)后的新的生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制。方法：采用生物信息學(xué)方法對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫和Target的骨肉瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析、功能富集、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析、生存分析和風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建等。常規(guī)H-E和免疫組織化學(xué)染色分析冠蛋白1A（coronin 1A， CORO1A）在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，并轉(zhuǎn)染si-CORO1A和HA-CORO1A，驗(yàn)證CORO1A低表達(dá)和高表達(dá)對(duì)程序性細(xì)胞死亡-配體1（programmed cell death ligand 1， PD-L1）的影響。結(jié)果：CORO1A基因在骨肉瘤患者中高表達(dá)，CORO1A基因的表達(dá)與骨肉瘤中抗腫瘤免疫細(xì)胞的比例呈正相關(guān)，并預(yù)示著較好的生存與預(yù)后。CORO1A可促進(jìn)PD-L1蛋白表達(dá)，兩者呈正相關(guān)。結(jié)論：CORO1A基因促進(jìn)抗腫瘤免疫以利于生存，是骨肉瘤患者獨(dú)立預(yù)后的生物標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]" "骨肉瘤；冠蛋白1A；生物標(biāo)志物；預(yù)后；免疫細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]" "R738.1" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號(hào)]" "1674-7887（2025）02-0120-07

Role of CORO1A in anti-tumor immunity and prognosis in osteosarcoma*

TANG Tao**， CHEN Xi， DA Wenyue， WANG Hui***" " " " （Department of Pathology， First People？蒺s Hospital of Changzhou， Jiangsu 213003）

[Abstract]" "Objective： To find new biomarkers for anti-tumor immunity and prognosis of osteosarcoma and mechanisms. Methods： Bioinformatics methods were used to perform differential analysis， functional enrichment， immune cell infiltration analysis， survival analysis and risk model construction on osteosarcoma data from GEO and Target， and H-E and immun-ohistochemical staining were performed to analyse coronin 1A（CORO1A） osteosarcoma tissues. Si-CORO1A and HA-CORO1A were transfected to verify the effect of low and high expression of CORO1A on programmed cell death ligand 1（PD-L1）. Results： The CORO1A gene was highly expressed in osteosarcoma patients. The expression of the CORO1A gene was positively correlated with the proportion of anti-tumor immune cells in osteosarcoma and predicted better survival and prognosis. CORO1A can promote the expression of PD-L1 protein， and the two are positively correlated. Conclusion： The CORO1A gene promotes antitumor immunity to facilitate survival and is an independent prognostic biomarker for osteosarcoma patients.

[Key words]" "osteosarcoma; coronin 1A; biomarker; prognosis; immune cell

骨肉瘤是骨的原發(fā)惡性腫瘤，其特征是惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生類骨質(zhì)或不成熟骨，發(fā)病率為每年每百萬人2～3例，多發(fā)于青少年[1-2]。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤患者的治療效果得到了一定的提高[3-5]。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療是以包含多柔比星、順鉑、大劑量甲氨蝶呤（MAP方案）為基礎(chǔ)組成的新輔助化療-手術(shù)-輔助化療綜合治療模式。大多數(shù)骨肉瘤患者明確診斷時(shí)已存在亞臨床的轉(zhuǎn)移性疾病[6-8]，患者預(yù)后無顯著改善。因此，探尋骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找評(píng)估預(yù)后新的生物標(biāo)志物對(duì)患者的治療至關(guān)重要。有證據(jù)[9]表明，除了基因突變外，腫瘤微環(huán)境，特別是免疫細(xì)胞，也參與了骨肉瘤的發(fā)展。

本課題組前期對(duì)公共數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的挖掘，采用生物信息學(xué)的方法對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫和Target的骨肉瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，找到了眾多影響骨肉瘤患者預(yù)后的差異基因[10]，如冠蛋白1A（coronin 1A， CORO1A）、骨髓細(xì)胞瘤癌基因（myelocytomatosis oncogene， MYC）、過氧化氫酶（catalase， CAT）等。CORO1A基因與細(xì)胞的凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)，與骨肉瘤相關(guān)的研究較為少見，為進(jìn)一步探討CORO1A基因在骨肉瘤中發(fā)揮的作用。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)分析CORO1A基因與腫瘤免疫微環(huán)境中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的關(guān)系，并通過免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry， IHC）和蛋白印跡探討該基因在骨肉瘤中的表達(dá)情況及其與程序性細(xì)胞死亡-配體1（programmed cell death ligand 1， PD-L1）的關(guān)系，旨在為骨肉瘤治療提供新的策略。

1" "材料與方法

1.1" "樣本來源" "GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE42352數(shù)據(jù)集（測(cè)試集）：正常樣本數(shù)15例，腫瘤樣本數(shù)103例[11-12]。從Target網(wǎng)站下載Target-OS數(shù)據(jù)集（驗(yàn)證集）：腫瘤樣本數(shù)101例，包含臨床信息患者數(shù)96例。臨床樣本來源于2021年5月—2024年5月在常州市第一人民醫(yī)院手術(shù)的骨肉瘤患者，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批文號(hào)：（2021）科第069號(hào)]，并獲得每例患者的知情同意。U2OS骨肉瘤細(xì)胞株（貨號(hào)：HTX1634）購自深圳華拓細(xì)胞庫。

1.2" "H-E染色和IHC" "標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、常規(guī)制片，H-E染色。IHC采用DAKO Omins全自動(dòng)免疫組化儀，一抗PD-L1（克隆號(hào)：22C3）購自Dako公司，一抗CORO1A（克隆號(hào)：OTI1A5）、CD8A（克隆號(hào)：SP16）和CD56（克隆號(hào)：UMAB83）購自北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司。操作步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。根據(jù)顯微鏡下200倍的染色程度和染色強(qiáng)度評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平。染色程度評(píng)分為0～4分：0分，0%；1分，≤10%；2分，gt;10%～50%；3分，gt;50%～80%；4分，gt;80%～100%。染色強(qiáng)度分為弱染色、中染色、強(qiáng)染色3個(gè)等級(jí)，相應(yīng)的強(qiáng)度分?jǐn)?shù)范圍為1～3分。最終的IHC分?jǐn)?shù)為染色程度評(píng)分乘以染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。

1.3" "免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析" "通過R語言的CIBERSORT[13]和TISIDB[14]計(jì)算不同CORO1A mRNA表達(dá)狀態(tài)的骨肉瘤組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocyte， TIL）的相對(duì)豐度。

1.4" "差異表達(dá)分析" "通過R語言的limma包[15]進(jìn)行差異分析，根據(jù)組間差異變化倍數(shù)（fold change）及差異顯著性（P value）來篩選差異（共表達(dá)）基因，設(shè)定|logFC|＞1和adj.P＜0.05為閾值。

1.5" "GO和KEGG分析" "采用clusterProfiler包[16]進(jìn)行差異基因的GO和KEGG分析，并使用ggplot2包進(jìn)行可視化。GO分析包括生物學(xué)過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）、細(xì)胞組分（cellular component， CC）。

1.6" "ROC曲線評(píng)估診斷性能" "通過pROC包[17]繪制ROC曲線，分析15例正常樣本和103例骨肉瘤樣本中CORO1A表達(dá)量的差異，并確定產(chǎn)生最高似然比的最佳截?cái)嘀狄耘袛郈ORO1A對(duì)骨肉瘤的識(shí)別閾值。并使用survivalROC包[18]驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)骨肉瘤生存預(yù)后的準(zhǔn)確性。AUCgt;0.5則能夠直觀反映生物標(biāo)志物對(duì)疾病的診斷價(jià)值。同時(shí)，AUC越接近1，離（0， 1）點(diǎn)越近，證明診斷試驗(yàn)的真實(shí)性越好。

1.7" "生存分析" "使用survival包進(jìn)行Target-OS數(shù)據(jù)集生存分析，包括總生存時(shí)間（overall survival， OS）、無事件（疾病）生存時(shí)間（disease free survival， DFS）、疾病進(jìn)展時(shí)間（time to progress， TTP）。并通過驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)骨肉瘤患者的總生存預(yù)后進(jìn)行分析。

1.8" "siRNA干擾實(shí)驗(yàn)和HA-pCDNA實(shí)驗(yàn)" "傳代骨肉瘤細(xì)胞U2OS至6孔板，待生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，加抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞8 h；Lipo3000分別轉(zhuǎn)染CORO1A-siRNA（正義鏈5？蒺-CCAUGACAGUGCC-UAGAAAdTdT-3？蒺，反義鏈5？蒺-UUUCUAGGCACUGUCAUGGdTdT-3？蒺）和HA-CORO1A（正義鏈5？蒺-ATGA-GCCGGCAGGTGGTC-3？蒺，反義鏈5？蒺-CTACTTGGCC-TGGACTGTCTC-3？蒺）至U2OS細(xì)胞，6 h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，空載體組作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.9" "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" "采用Excel（Microsoft）和R統(tǒng)計(jì)軟件（版本4.0.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。CORO1A和TIL之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "CORO1A在骨肉瘤中的異常表達(dá)及預(yù)后價(jià)值" "首先，評(píng)估分析TIMER中所有TCGA癌癥組織中CORO1A的分布，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤中CORO1A表達(dá)顯著上調(diào)，包括肉瘤組織（sarcoma， SARC），見圖1A。為進(jìn)一步驗(yàn)證CORO1A基因在骨肉瘤中的表達(dá)情況，將TCGA的骨肉瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CORO1A基因在骨肉瘤中高表達(dá)，與正常組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），見圖1B。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，CORO1A基因高表達(dá)患者的DFS和OS較低表達(dá)患者明顯延長(zhǎng)（Plt;0.01），提示CORO1A基因高表達(dá)是腫瘤患者較好的預(yù)后指標(biāo)，見圖1C～D。

2.2" "CORO1A基因在骨肉瘤中的診斷價(jià)值" "為分析CORO1A基因在骨肉瘤中的診斷價(jià)值，用TCGA的數(shù)據(jù)構(gòu)建ROC曲線和nomogram預(yù)測(cè)模型，結(jié)果顯示CORO1A基因在骨肉瘤中有較高的診斷價(jià)值，且骨肉瘤中CORO1A基因的表達(dá)情況可以預(yù)測(cè)患者1、3、5年的生存率，見圖2。

2.3" "CORO1A與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)聯(lián)" "為了解CORO1A基因在骨肉瘤預(yù)后中的潛在機(jī)制，采用TISIDB分析所有TCGA腫瘤中哪些類型的TIL可能受到CORO1A的調(diào)節(jié)，以此來探討CORO1A與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)聯(lián)，見圖3A。在肉瘤中CORO1A與B細(xì)胞（r=0.742， Plt;0.001）、激活的CD8+T細(xì)胞（active CD8， Act CD8）（r=0.855， Plt;0.001）和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell， NK細(xì)胞）（r=0.684， Plt;0.001）呈正相關(guān)，見圖3B～D。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CORO1A與免疫相關(guān)的C-C基序趨化因子配體（C-C motif chemokine ligand， CCL）2（r=0.660， Plt;0.001）、CCL3（r=0.730， Plt;0.001）和CCL4（r=0.817， Plt;0.001）呈正相關(guān)，見圖3E～G。此外，還采用CIBERSORT驗(yàn)證CORO1A mRNA差異表達(dá)對(duì)骨肉瘤患者腫瘤免疫微環(huán)境中狀態(tài)的影響。CORO1A mRNA高表達(dá)組（紅色為高表達(dá)組，藍(lán)色為低表達(dá)組）的抗腫瘤免疫細(xì)胞比例較高，如CD8+T細(xì)胞（CD8T）（Plt;0.05）、記憶B細(xì)胞（Plt;0.05），而促腫瘤免疫細(xì)胞比例較低，如單核細(xì)胞（Mono）（Plt;0.05）、M2巨噬細(xì)胞（M2）（Plt;0.05），見圖3H。結(jié)果表明，CORO1A與骨肉瘤的抗腫瘤免疫相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證CORO1A與骨肉瘤患者較好預(yù)后的相關(guān)性。并且提示通過預(yù)測(cè)這些免疫細(xì)胞的靶點(diǎn)小分子藥物，通過改善免疫細(xì)胞分布比例，進(jìn)而達(dá)到治療骨肉瘤的目的。

2.4" "CORO1A不同表達(dá)組的差異基因分析和富集的生物學(xué)過程" "以CORO1A在測(cè)試集的103例腫瘤樣本中表達(dá)中位值進(jìn)行分組，其中低表達(dá)組51例，高表達(dá)組52例；同樣對(duì)驗(yàn)證集Target數(shù)據(jù)庫的101例骨肉瘤患者以CORO1A表達(dá)中位值分組，高表達(dá)組50例和低表達(dá)組51例。使用limma包進(jìn)行差異分析，設(shè)定|logFC|＞1和adj.P＜0.05為閾值，對(duì)兩組差異基因取交集，進(jìn)行GO和KEGG富集分析。發(fā)現(xiàn)富集到的生物學(xué)過程有抗原加工提呈、免疫效應(yīng)過程的調(diào)控及MHC Ⅱ類分子的抗原遞呈等，見圖4，進(jìn)一步驗(yàn)證了CORO1A有助于骨肉瘤中抗腫瘤免疫微環(huán)境。

2.5" "骨肉瘤組織中CORO1A高表達(dá)與部分腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的關(guān)聯(lián)分析" "為進(jìn)一步驗(yàn)證骨肉瘤組織中CORO1A高表達(dá)對(duì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的影響，對(duì)骨肉瘤患者的組織進(jìn)行IHC。結(jié)果顯示，具有高表達(dá)豐度的CORO1A的腫瘤組織中，與抗腫瘤免疫相關(guān)的免疫細(xì)胞CD8+T細(xì)胞（CD8A標(biāo)記）和CD56+NK細(xì)胞也呈現(xiàn)出高表達(dá)豐度，見圖5A。此外，高表達(dá)豐度的CORO1A腫瘤組織中，PD-L1有呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)。相關(guān)性分析顯示，骨肉瘤組織中CORO1A的表達(dá)與PD-L1、CD8A和CD56均呈正相關(guān)（r=0.95、0.74、0.62，均Plt;0.001），見圖5B。結(jié)果顯示，在骨肉瘤組織中，CORO1A高表達(dá)組中PD-L1、CD8A和CD56的表達(dá)明顯高于CORO1A低表達(dá)組（Plt;0.001），見圖5C。

2.6" "CORO1A基因?qū)D-L1蛋白表達(dá)的影響" "為進(jìn)一步驗(yàn)證CORO1A與PD-L1兩者的關(guān)系，采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)CORO1A不同表達(dá)狀態(tài)下，PD-L1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染si-CORO1A抑制CORO1A表達(dá)后，PD-L1蛋白表達(dá)也隨之降低，CORO1A高表達(dá)后，PD-L1蛋白表達(dá)也升高（Plt;0.001），見圖6。

3" "討" " " 論

CORO1A與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移等生物學(xué)過程密切相關(guān)。X.F.FEI等[19]研究發(fā)現(xiàn)CORO1A可通過擬素化修飾直接結(jié)合RAS癌基因家族成員7（Ras-related GTP binding protein 7， Rab7）促進(jìn)多泡體募集和Rab7的激活，隨后多泡體以依賴Rab7的方式降解，導(dǎo)致細(xì)胞外囊泡分泌減少，從而在腫瘤發(fā)展中扮演著重要角色。近年來，研究[20]發(fā)現(xiàn)CORO1A在一些癌癥中起到監(jiān)控疾病進(jìn)展的作用，但在骨肉瘤中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫的骨肉瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CORO1A在骨肉瘤患者中高表達(dá)，且高表達(dá)的COR-O1A在骨肉瘤中具有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值，并通過生物信息學(xué)分析證實(shí)CORO1A的高表達(dá)在骨肉瘤的發(fā)展中起到防御作用。

腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、血管生成以及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并能調(diào)控免疫細(xì)胞的數(shù)量和分化[21]。有證據(jù)[22]表明，腫瘤進(jìn)展可能是癌細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視的結(jié)果。明確腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞可能有助于闡明CORO1A在骨肉瘤中的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)CORO1A在骨肉瘤中高表達(dá)，CORO1A高表達(dá)的患者，其DFS和OS明顯延長(zhǎng)，且其抗腫瘤免疫細(xì)胞比例較高，而促腫瘤免疫細(xì)胞比例較低。此外，還發(fā)現(xiàn)CORO1A的差異表達(dá)基因富集到免疫相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，且與CD8A、CD56以及免疫相關(guān)趨化因子CCL2、CCL3和CCL4呈正相關(guān)，這些基因都與NK細(xì)胞和T細(xì)胞募集有關(guān)，在抑制腫瘤生長(zhǎng)和改善預(yù)后方面發(fā)揮重要作用[23]。結(jié)果提示CORO1A是骨肉瘤獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，CORO1A是通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)來促進(jìn)抗腫瘤免疫。

有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)GEO和Target中CORO1A的表達(dá)還與PD-L1呈正相關(guān)，抑制CORO1A基因PD-L1蛋白表達(dá)明顯被降低。浙江大學(xué)蔡志堅(jiān)團(tuán)隊(duì)[24]研究表明敲除CORO1A可抑制內(nèi)源性細(xì)胞外囊泡的產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)抗PD-L1抗體治療耐藥。多項(xiàng)研究[25-26]表明，腫瘤內(nèi)大量CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)能夠在某種程度上緩解對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的耐藥性。因此驗(yàn)證CORO1A是否可以預(yù)測(cè)骨肉瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)是很有希望。本研究結(jié)果可為患者免疫治療，特別是骨肉瘤患者提供新的見解，幫助臨床醫(yī)師為骨肉瘤患者選擇適當(dāng)?shù)拇胧┎⒏纳祁A(yù)后。

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[收稿日期] 2024-11-08