澳洲堅果鋅指蛋白基因MiZFP9的克隆與功能分析

摘要：【目的】克隆澳洲堅果CCCH型鋅指蛋白基因MiZFP9，并分析其在不同組織及低溫、干旱脅迫下的表達情況，為深入探究澳洲堅果鋅指蛋白基因的抗寒和耐旱分子機理提供理論依據。【方法】從澳洲堅果葉片克隆MiZFP9基因，并對其進行生物信息學分析。通過實時熒光定量PCR檢測MiZFP9基因在不同組織中的表達特性及低溫和干旱脅迫下的表達模式。【結果】從澳洲堅果葉片中克隆獲得MiZFP9基因，屬于CCCH型鋅指蛋白基因C3H64亞類，其編碼蛋白含有活性位點、Zn2＋結合位點及CCCH型鋅指蛋白的典型結構域ZF_C3H，為穩定的親水性蛋白，以絲氨酸磷酸化為主，可能定位于細胞質，屬于非分泌型蛋白。MiZFP9蛋白的高級結構主要由無規則卷曲、α-螺旋和延伸鏈交錯組成。MiZFP9基因在Own Choice品種的不同組織中均顯著差異表達（Plt;0.05，下同），其中在剛開放和未開放小花中的相對表達量最高，其次是根和葉，而在莖的相對表達量則最低。在低溫脅迫和干旱脅迫下，MiZFP9基因在Own Choice和HAES695品種的相對表達量較對照（處理0 h）均顯著上調，其中MiZFP9基因在Own Choice品種中呈先升高后降低的表達模式，在HAES695品種的相對表達量呈波動式變化模式，出現2個峰值，說明其在不同品種中的響應模式存在差異。【結論】MiZFP9基因具有組織表達特異性，并在低溫和干旱處理后表達水平明顯升高，推測MiZFP9在澳洲堅果組織生長發育及響應低溫和干旱脅迫中發揮重要的正向調控作用。

關鍵詞：澳洲堅果；CCCH型鋅指蛋白；基因克隆；功能分析

中圖分類號：S664.9文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0544-09

Cloning and functional analysis of zinc finger protein gene MiZFP9 from macadamia

YANG Xiang-yan，CAI Yuan-bao*，HUANG Si-jie，LI Ji-dong，PAN Ru-jun，HUANG Yun-peng

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Quality and Safety Control for SubtropicalFruits，Nanning，Guangxi 530001，China）

Abstract：【Objective】To clone CCCH type zinc finger protein gene MiZFP9 from macadamia（Macadamia integrifo-lia）and analyze its expression in different tissues and under cold and drought stresses，which could provide scientific ba-sis for molecular mechanism of zinc finger protein from macadamia in response to cold and drought stresses.【Method】Gene MiZFP9 was cloned from macadamia leaves，and bioinformatics analysis was conducted.The expression levels of MiZFP9 in different organs of macadamia and under cold and drought stresses were investigated by real-time fluorescence quantitative PCR technology.【Result】MiZFP9 gene was cloned from macadamia leaves and belonged to the C3H64 sub-class of CCCH type zinc finger protein gene.The encoded protein contained active sites，Zn2+binding sites as well as typi-cal domains ZF_C3H of CCCH type zinc finger protein，which was a stable hydrophilic protein and was mainly serine phosphorylation.It may be localized in the cytoplasm and was a non-secretory protein.The higher structure of MiZFP9"protein was mainly composed of random coil，α-helix and extended chain interlacing.MiZFP9 gene was expressed signifi-cantly differently in different tissues of Own Choice variety（Plt;0.05，the same below），among which the relative expres-sion level of MiZFP9 was the highest in newly opened and unopened flowers，followed by roots and leaves，while the relative expression level of MiZFP9 was the lowest in stems.Under low temperature stress and drought stress，the relative expression level of MiZFP9 gene in both Own Choice and HAES695 varieties was significantly up-regulated compared with the control（treated for 0 h），and the expression pattern of MiZFP9 gene was first increased and then decreased in Own Choice variety，the relative expression in HAES695 showed a fluctuating pattern with 2 peaks indicating that the re-sponse patters of different varieties were different.【Conclusion】MiZFP9 gene is specifically expressed in macadamia tis-sues，and is significantly up-regulated under cold and drought stresses，which speculates that MiZFP9 may play important positive regulatory roles in the growth and development of macadamia tissues and the response to cold and drought stresses.

Key words：macadamia；CCCH zinc finger protein；gene cloning；functional analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31860537）；Guangxi Key Research and Develop-ment Plan Project（Guinongke AB241484005）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT154，Guinongke 2023ZX19）

0引言

【研究意義】澳洲堅果（Macadamia spp.）別名夏威夷果，原產于澳洲亞熱帶雨林地區，但在我國的栽培面積卻位居世界第一位。由于全球極端氣候頻發，而我國澳洲堅果主產區主要分布在山區，導致低溫和干旱成為影響我國澳洲堅果生長發育及穩產的主要因素（Herbert et al.，2019）。鋅指是一種通過結合Zn2＋保持穩定鋅指結構域的蛋白結構基元，鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）在DNA識別、RNA修飾、細胞分化與凋亡、蛋白—蛋白互作等新陳代謝中發揮重要作用（Bollier etal.，2022），尤其在調控植物生長發育、應答逆境脅迫中起重要作用（Han et al.，2021）。因此，開展澳洲堅果鋅指蛋白的生物學功能研究，對于闡明澳洲堅果響應低溫和干旱脅迫的分子機理具有重要的指導意義。【前人研究進展】鋅指蛋白可根據鋅指結構域中與Zn2＋相結合的半胱氨酸（C）和組氨酸（H）位置和數量進行分類，可分為C2H2、C2HC、C2HC5、C3H（即CCCH）、C3HC4、C4、C4HC3、C6、C8共九大類型（Bollier etal.，2022）。目前，功能相關研究最多的是C2H2型鋅指蛋白，CCCH型鋅指蛋白的相關研究相對較少（Liu et al.，2022b）。CCCH型鋅指蛋白包含1～6個C3H型鋅指基序，其基序的基本序列特征是C-X4-17-C-X4-6-C-X3-4-H（X代表任意氨基酸）（Han et al.，2021）。目前，植物CCCH型鋅指蛋白家族已從擬南芥和水稻（Wang et al.，2008）、毛果楊（Chai et al.，2012）、番茄（Xu，2014）、馬鈴薯（Denget al.，2023）等物種中被鑒定。但僅少數的CCCH型鋅指蛋白成員在植物的功能得到研究及驗證。相關研究結果顯示，植物CCCH型鋅指蛋白基因在種子發芽、葉片衰老、器官組織生長發育（Kong et al.，2006；Kimetal.，2008）及響應致病菌侵染等生物脅迫（Deng et al.，2012），尤其是響應低溫、干旱、鹽等非生物脅迫中起重要調控作用（Xie et al.，2019；Han et al.，2021；Liu et al.，2022a；Zhang et al.，2023）。在CCCH型鋅指蛋白基因響應低溫脅迫研究方面，如番茄SIC3H39、擬南芥AtTZF1和菊花DgC3H1基因可增強轉基因植株的耐寒性（Lin et al.，2011；Bai et al.，2021；Xu et al.，2023a）。在CCCH型鋅指蛋白基因響應干旱脅迫研究方面，如水稻OsC3H47和OsTZF1基因和蠟梅CpC3H3基因可增強轉基因植株的耐旱性（Wang et al.，2015；Ilyaset al.，2022；Liu et al.，2022a）。【本研究切入點】目前已通過澳洲堅果抗寒和耐旱轉錄組測序分析，篩選出1個顯著表達的CCCH型鋅指蛋白基因。但迄今為止在國內外澳洲堅果CCCH型鋅指蛋白基因的克隆及功能研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】從澳洲堅果葉片克隆CCCH型鋅指蛋白基因MiZFP9，利用生物信息學分析其編碼蛋白序列特征，并通過實時熒光定量PCR檢測MiZFP9基因在不同組織及低溫和干旱脅迫的表達情況，以期為澳洲堅果CCCH型鋅指蛋白基因響應低溫和耐旱的分子機制及抗寒和耐旱品種選育提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料是由廣西亞熱帶作物研究所提供的澳洲堅果（Macadamia integrifolia）品種Own Choice和HAES695，其中Own Choice品種用于基因克隆和不同組織的表達分析，Own Choice和HAES695品種用于低溫和干旱脅迫的表達分析。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高保真酶、Ex Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾維贊生物科技有限公司。主要儀器設備：CFX96 Real-Time PCR System熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2樣品處理及采集

采集澳洲堅果Own Choice品種嫁接苗苗期的根、莖、葉、花期未開放和剛開放的小花及結果期謝花后30～45 d的小果，用于組織表達分析。對苗期的澳洲堅果Own Choice和HAES695品種嫁接苗分別進行4℃低溫處理，處理時間（0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h）和20%的PEG6000干旱處理，處理時間（1.0、3.0、6.0、12.0、24.0和36.0 h），按脅迫時間點采集脅迫處理的葉片，處理0 h設為對照（CK），每個試驗重復3次，用于低溫和干旱脅迫表達分析。

1.3總RNA提取及cDNA第一鏈合成

參照蔡元保等（2014）改良的CTAB法提取純化澳洲堅果樣品的總RNA，經RNA質量和濃度檢測合格后，通過反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.4 MiZFP9基因cDNA克隆

通過澳洲堅果抗寒和耐旱轉錄組測序分析，篩選出1個高表達的CCCH型鋅指蛋白基因MiZFP9。利用Primer Premier 5.0設計MiZFP9基因編碼區（CDS）的擴增引物ZFP9-F和ZFP9-R（表1）。以Own Choice品種葉片的cDNA為模板，ZFP9-F和ZFP9-R為引物，PCR擴增MiZFP9基因cDNA全長。反應體系20.0μL：cDNA模板1.0μL，2×Primer STAR Max 10.0μL，上、下游引物各0.8μL，無菌ddH2O補足至20.0μL。擴增程序：95℃預變性5 min；95℃35 s，59.2℃40 s，72℃120 s，進行32個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化PCR產物，并連接至pMD20-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5生物信息學分析

利用NCBI數據庫和SMART分析MiZFP9蛋白的保守結構域和功能基元，分析該蛋白的所屬鋅指蛋白家族。通過NCBI數據庫進行蛋白同源序列搜索，利用DNAMAN 9.0進行氨基酸序列同源比對，并以Observed Divergency法構建同源蛋白的系統發育進化樹（Bootstrap為1000）。采用ExPASy的Prot‐Param預測蛋白的理化性質。通過NetPhos 3.1預測蛋白的磷酸化位點，通過PSORT和Euk-mPLOC預測蛋白的亞細胞定位，通過SignalP-5.0和TMHMM-2.0預測蛋白的信號肽和跨膜結構域。采用SOPMA和SWISS-MODEL預測蛋白的二級結構和三級結構。

1.6 MiZFP9基因表達分析

采用Primer Premier 5.0設計MiZFP9基因的實時熒光定量PCR引物QZFP9-F和QZFP9-R，以及內參基因引物QMDH-F和QMDH-R（表1）。用澳洲堅果蘋果酸脫氫酶基因MDH作為內參基因（蔡元保等，2021b，2022），以Own Choice和HAES695品種cDNA為模板，通過熒光定量PCR檢測MiZFP9基因在不同器官組織及低溫和干旱脅迫下葉片中的表達情況。參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix的說明配制實時熒光定量PCR的反應體系。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃15 s，58.0℃30 s（表1），72℃延伸30 s，進行40個循環。試驗重復和樣品重復均設3次。

1.7統計分析

應用2-ΔΔCt方法計算澳洲堅果MiZFP9基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），通過Excel 2020分析數據及作圖，并使用SPSS 18.0對相對表達量進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1 MiZFP9基因的cDNA克隆結果

以澳洲堅果Own Choice品種葉片的cDNA為模板，以ZFP9-F和ZFP9-R為引物擴增MiZFP9基因的CDS序列。序列擴增、測序及同源比對結果（圖1）顯示，MiZFP9基因全長2485 bp，CDS序列中的開放閱讀框（ORF）為1821 bp，編碼606個氨基酸殘基，與其他植物鋅指蛋白基因序列相似性均在69.87%以上。因此，該基因命名為MiZFP9，Gen‐Bank登記號為MT332639。

2.2 MiZFP9蛋白的同源性比對結果

篩選與MiZFP9蛋白高度同源的已知鋅指蛋白，并進行氨基酸序列多重比對，結果（圖2）顯示，MiZFP9蛋白與其他植物CCCH型鋅指蛋白的氨基酸序列高度相似，其中與蒂羅花（Telopea specio-sissima）TsC3H64（XP_043707197.1）的相似性高達90.10%，與蓮（Nelumbo nucifera）NnC3H64（XP_010 262113.1）達77.36%，與葡萄（Vitis vinifera）VvC3H64（XP_059596855.1）的相似性達72.07%，與河岸葡萄（Vitis riparia）VrC3H64（XP_034700474.1）的相似性達71.95%。蛋白結構域分析結果顯示，這些CCCH型鋅指蛋白均含有活性位點和Zn2＋結合位點，尤其是均含有2個CCCH型鋅指蛋白的典型結構域ZF_C3H（Zinc finger C3H-type profile）。

2.3 MiZFP9蛋白系統進化關系分析

為明確澳洲堅果MiZFP9蛋白與其他植物CCCH型鋅指蛋白的系統進化關系，篩選出35個植物中具代表性的CCCH型鋅指蛋白構建系統發育進化樹，結果如圖3所示。整個系統發育進化樹分成兩大分支（Ⅰ和Ⅱ），其中分支Ⅰ又分成2個亞分支（A和B），每個亞分支均可分成2個小分支（A-1和A-2，B-1和B-2）；MiZFP9蛋白被分在B-2小分支上，與蒂羅花TsC3H64（XP_043707197.1）、蓮NnC3H64（XP_010262113.1）和華蓋木MsC3H64（XP_058073972.1）的親緣關系最近。同時，從系統發育進化樹可知，MiZFP9蛋白屬于CCCH型鋅指蛋白的C3H64亞類，與C3H59亞類成員的親緣關系較近。

2.4 MiZFP9蛋白的理化性質分析結果

MiZFP9蛋白的理化性質分析結果顯示，MiZFP9蛋白的分子式C3021H4674N830O903S24，分子量67.8388 kD，總原子數9452個，理論等電點6.51，脂肪系數74.19，不穩定系數34.60，平均親/疏水性指數-0.422。可見，MiZFP9蛋白為穩定的親水性蛋白。

2.5 MiZFP9蛋白磷酸化位點、亞細胞定位、跨膜域及信號肽分析結果

NetPhos 3.1預測結果（圖4）顯示，MiZFP9蛋白磷酸化位點中絲氨酸有40個（占64.51%），蘇氨酸有13個（占20.97%），酪氨酸有9個（占14.52%），說明MiZFP9蛋白發揮生物學功能主要依靠絲氨酸磷酸化。PSORT和Euk-mPLOC預測結果顯示，MiZFP9蛋白定位于細胞質。TMHMM-2.0和SignalP-5.0預測結果顯示，MiZFP9蛋白不存在信號肽序列和跨膜結構域，屬于非分泌非跨膜蛋白。

2.6 MiZFP9蛋白的高級結構預測結果

SOPMA預測結果（圖5）顯示，MiZFP9蛋白的二級結構基元是無規則卷曲（55.94%）、α-螺旋（23.76%）、延伸鏈（16.17%）和β-轉角（4.13%）。以SWISS-MODEL數據庫中木薯（Manihot esculenta）CCCH型鋅指蛋白（A0A2C9W6C7.1.A）為同源模板，構建MiZFP9蛋白的三級結構，結果（圖6）顯示，MiZFP9蛋白與模板蛋白的結構相似性為71.10%，GMQE值為0.82，該蛋白主要由無規則卷曲、α-螺旋和延伸鏈交錯組成，和二級結構的分析結果類似。

2.7 MiZFP9基因的組織表達分析結果

MiZFP9基因在不同組織的表達分析結果（圖7）顯示，該基因在Own Choice品種的根、莖、葉、未開放和剛開放的小花及小果中的相對表達量均存在顯著差異（Plt;0.05，下同），其中在剛開放和未開放小花中的相對表達量較高，其次是根和葉，而在莖中的相對表達量則最低，推測MiZFP9基因參與調控澳洲堅果不同組織（尤其是小花）的生長發育，具有明顯的組織表達特異性。

2.8 MiZFP9基因在低溫脅迫下的表達分析結果

由圖8可知，低溫脅迫后MiZFP9基因在Own Choice和HAES695品種的相對表達量較對照（處理0 h）均顯著上調，其中在Own Choice品種低溫脅迫后呈先升高后降低的表達模式，在處理12.0 h達高峰值；在HAES695品種低溫脅迫后的相對表達量呈波動的變化模式，出現2個峰值，在處理1.0 h達小高峰，在處理6.0 h達最高峰，推測MiZFP9基因響應低溫脅迫，但在不同品種中的響應模式存在差異。

2.9 MiZFP9基因在干旱脅迫的表達分析結果

由圖9可知，MiZFP9基因在Own Choice和HAES695品種中受干旱脅迫后的相對表達量較對照（處理0 h）均顯著上調，其中在Own Choice品種中整體呈先升高后降低的表達模式，在處理12.0 h時達高峰值；在HAES695品種中整體呈波動變化的表達模式，在處理3.0 h達小高峰，在處理24.0 h達最高峰，推測MiZFP9基因響應干旱脅迫，在不同品種的響應模式也有所差異。

3討論

CCCH型鋅指蛋白是植物中常見的具有1～6個CCCH型鋅指基序的轉錄因子，主要通過與DNA、RNA結合進行互作（Cook et al.，2015；皮博藝等，2019）。目前，已有多種植物的CCCH型鋅指蛋白家族基因被鑒定，其中模式植物擬南芥和水稻最早被鑒定，隨后番茄、馬鈴薯、毛果楊等植物的CCCH型鋅指蛋白家族基因也相繼被鑒定（Han et al.，2021；Bollier etal.，2022）。但迄今為止，在植物中只有少數該家族成員的生物學功能被研究報道。本研究從澳洲堅果克隆獲得MiZFP9基因，與該家族C3H64亞類成員具有極高的蛋白序列和結構相似性，并含有該家族典型的ZF_C3H結構域和Zn2＋結合位點。因此，MiZFP9是CCCH型C3H64亞類鋅指蛋白的一個新成員。

氨基酸的磷酸化修飾作用是蛋白功能發揮的一個重要過程（蔡元保等，2021a，2022）。本研究發現，MiZFP9為穩定的親水性蛋白，主要依靠絲氨酸磷酸化，說明澳洲堅果MiZFP9蛋白利用絲氨酸位點的磷酸化修飾行使其蛋白功能。研究結果顯示，植物CCCH型鋅指蛋白能定位在細胞的不同區域，如擬南芥GDS1、水稻OsC3H12、菊花DgC3H1定位在細胞核內（Denget al.，2012；Kimetal.，2016；Bai etal.，2021）；側金盞花AaZFP3、油菜BcMF30a和BcMF30c定位在細胞質中（Wang et al.，2022；Xu etal.，2023b）；蠟梅CpC3H3定位在細胞膜上（Liu et al.，2022a）。MiZFP9蛋白是非分泌型蛋白，可能定位在細胞質中，但需通過后續亞細胞定位試驗進行精準定位。

植物CCCH型鋅指蛋白基因的組織表達相對廣泛，調控種子發芽、葉片衰老、器官組織的生長發育等，如在擬南芥不同組織中該家族基因廣泛表達（Wang et al.，2008），而且SOMNUS基因和AtC3H17基因在種子發芽、開花、營養發育等發揮重要作用（Kimetal.，2008；Seok et al.，2016）；水稻OsDOS基因、油菜BcMF30a和BcMF30c基因在推遲葉片衰老、誘導花粉敗育中發揮重要調控作用（Kong et al.，2006；Xu etal.，2023b）。本研究發現，MiZFP9基因在澳洲堅果不同組織的相對表達量差異顯著，具有組織表達特異性，尤其在剛開放和未開放的小花中高表達，因此，推測MiZFP9參與調控澳洲堅果不同組織（尤其是小花）的生長發育。

植物CCCH型鋅指蛋白基因在響應低溫脅迫中發揮重要調控作用，如番茄SIC3H39基因負調控其植株的耐寒性（Xu etal.，2023a），擬南芥AtTZF1基因和菊花DgC3H1基因可顯著提高轉基因植株的耐寒性（Lin etal.，2011；Bai etal.，2021）。此外，該家族基因在響應干旱脅迫中也發揮重要調控作用，如過表達水稻OsC3H47和OsTZF1基因也可增強植株的耐旱性（Wang et al.，2015；Ilyas et al.，2022）；蠟梅CpC3H3基因轉入擬南芥后植株的耐旱性增強（Liu et al.，2022a）。本研究發現，在低溫脅迫和干旱脅迫下MiZFP9基因在Own Choice和HAES695品種葉片中的相對表達量較處理0 h呈顯著上調，推測MiZFP9作為正調控基因，在澳洲堅果響應低溫和干旱脅迫中發揮重要調控作用。

4結論

MiZFP9基因具有組織表達特異性，并在低溫和干旱處理后表達水平明顯升高，推測MiZFP9基因在澳洲堅果組織生長發育及響應低溫和干旱脅迫中發揮重要的正向調控作用。

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（責任編輯：陳燕）