枝孢瓶霉屬合成菌群對(duì)生姜青枯病的生物防治

摘要：【目的】評(píng)價(jià)4株枝孢瓶霉屬（Cladophialophora spp.）深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）菌株的親緣關(guān)系及其合成菌群對(duì)生姜青枯病的防治效果，為生姜青枯病生防菌劑的研制與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以4株枝孢瓶霉屬菌株LC3、LJ1、MS2和HX2組成的合成菌群（T4）為材料，通過ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹明確4株供試菌株間的親緣關(guān)系；通過盆栽試驗(yàn)檢測(cè)T4對(duì)生姜青枯病的防治效果；通過大田試驗(yàn)，對(duì)比化學(xué)藥劑單獨(dú)使用（CK）、生防菌與化學(xué)藥劑配合使用（處理1）以及T4與化學(xué)藥劑配合使用（處理2）3種處理對(duì)生姜抗病指標(biāo)、生長(zhǎng)指標(biāo)和產(chǎn)量的影響；通過對(duì)應(yīng)試劑盒的檢測(cè)方法，測(cè)定T4對(duì)生姜防御酶活性的影響?！窘Y(jié)果】4株枝孢瓶霉屬菌株在基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上形成3個(gè)相互獨(dú)立的進(jìn)化分枝，其中菌株LC3與已知種Cladophialophora immunda的模式菌株聚在一起；菌株HX2單獨(dú)形成一個(gè)進(jìn)化枝，為新發(fā)表的新種Cladophialophora guangxiense；菌株LJ1和MS2聚在一起形成另一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化枝，鑒定為疑似新種Cladophialophora sp.nov.1。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，T4菌液處理的生姜苗平均株高較滅菌水浸根對(duì)照（CK）處理極顯著提高58.5%（Plt;0.01）；接種病原菌100 d時(shí)對(duì)生姜青枯病的防效為51.5%，青枯病發(fā)病率較CK降低22.2%。大田試驗(yàn)結(jié)果顯示，處理2的青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)分別較CK降低25.0%和68.6%，分蘗數(shù)、株幅和根狀塊莖長(zhǎng)度分別增加50.4%、12.8%和36.4%，生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量分別增加50.0%和55.6%。在病原脅迫下，與CK相比，T4處理的生姜地上莖的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化氫酶（CAT）、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性分別提高31.2%、25.1%、10.9%、7.1%、12.2%和32.1%。【結(jié)論】枝孢瓶霉合成菌群T4對(duì)生姜青枯病具有良好的防病和治療修復(fù)作用。枝孢瓶霉合成菌群T4可與殺菌劑配合使用，在生姜青枯病的生物防治方面具有良好的開發(fā)利用前景。

關(guān)鍵詞：生姜；青枯雷爾氏菌；深色有隔內(nèi)生真菌；促生；生物防治

中圖分類號(hào)：S436.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2025）02-0643-12

Biocontrol effects of Cladophialophora spp.synthetic fungus resistant to ginger bacterial wilt

ZENG Feng-hua1，XIE Ling1，HUANG Hao2，ZHOU Yu-jiao1，3，WEN Jun-li2，ZHAO Hui-li1，LONG Yan-yan1*，ZHOU Sheng-mao2*

（1Plant Protection Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Green Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory ofBiology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007，China；2Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Science，Nanning，Guangxi 530007，China；3College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】To evaluate the molecular phylogeny of 4 Cladophialophora spp.dark septateendophyte（DSE）strains and the effects of their synthetic microbial community（T4）on preventing ginger bacterial wilt，which could pro-vide theoretical basis for the exploitation and utilization of ginger bacterial wilt biocontrol agents.【Method】The synthetic microbial community（T4）composed of 4 strains of Cladophialophora spp.were used as the test material，and therela-tionship of the 4 tested strains was determined by phylogenetic tree based on ITS sequence.The effect of T4 on the control of ginger bacterial wilt was tested by pot experiment.Field tests were conducted to compare the effects of chemical agent alone（CK），biocontrol agent combined with chemical agent（treatment 1）and T4 combined with chemical agent（treat-ment 2）on resistance indexes，growth indexes and yield of ginger.Finally，using the corresponding assay kit method，the effects of T4 on defense enzyme activity in ginger were determined.【Result】The 4 strains of Cladophialophora spp.formed 3 independent evolutionary clades on phylogenetic tree based on ITS sequences.Strain LC3 and the type strain of the known species Cladophialophora immunda were clustered together，strain HX2 formed a single clade，which was a newly published new species Cladophialophora guangxiense；strains LJ and MS2 were clustered together to form another independent clade，which were identified as a suspected new species Cladophialophora sp.nov.1.In potted experiment，the average plant height of ginger seedlings treated with T4 was extremely significantly increased by 58.5%compared with the Sterile water root dipping control（CK）（Plt;0.01，the same below）.The control effect on ginger bacterial wilt was 51.5%after 100 d inoculated with pathogens，and the incidence rate decreased by 22.2%compared with CK.In the field test，compared with CK，the incidence rate and disease index of ginger bacterial wilt treated with treatment 2 were reduced by 25.0%and 68.6%respectively；the number of tillers，plant width and root tuber length increased by 50.4%，12.8%and 36.4%respectively；and the biological yield and economic yield increased by 50.0%and 55.6%respectively.Under pathogen stress，compared with the CK，peroxidase（POD），superoxide dismutase（SOD），polyphenol oxidase（PPO），catalase（CAT），chitinase andβ-1，3-glucanase activities in ginger stalk increased by 31.2%，25.1%，10.9%，7.1%，12.2%and 32.1%respectively.【Conclusion】The synthetic microbial community T4 of Cladophialophora spp.has good effect on prevention and treatment of ginger bacterial wilt.The synthetic microbial community T4 of Cladophia-lophora spp.can be used in combination with fungicides，which has a good development and utilization prospect in the biological control of ginger bacterial wilt.

Key words：ginger；Ralstonia solanacearum；dark septateendophyte；growth promotion；biological control

Foundation items：Guangxi Key Research and Development Plan Project（Guike AB21238002）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT065，Guinongke 2024YP082）

0引言

【研究意義】生姜（Zingiber officinate Roscoe）作為一種食藥同源的草本植物，被廣泛用于烹飪和藥用。我國(guó)的生姜種植面積、總產(chǎn)量和出口量均位居世界第一（吳曼等，2019）。然而，由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的生姜青枯病嚴(yán)重威脅著我國(guó)生姜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，生姜一旦發(fā)病，整田植株可能會(huì)相繼染病，造成生姜產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于生姜青枯病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，然而效果并不理想，且容易引發(fā)農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染、病原菌耐藥性、土壤微生態(tài)環(huán)境失衡等問題（劉貴猛等，2017；崔文艷等，2024）。生物防治被認(rèn)為是解決土傳病害的一條有效途徑（李興龍和李彥忠等，2015；張玲玲等，2021）。因此，篩選適用于生姜青枯病的生防微生物并加以合理利用，對(duì)生姜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今已有木霉（孫彩云等，2002；Wang et al.，2023）、放線菌（冉紅艷，2005；張成玲等，2008；徐瑩瑩等，2012）、枯草芽孢桿菌（劉勇等，2008；趙志祥等，2015；姜艷鵬等，2023）、阿氏腸桿菌和印度假單胞菌（黨柯柯等，2023）、巨大芽孢桿菌（汪茜等，2023b）、貝萊斯芽孢桿菌（崔文艷等，2024）等多種微生物對(duì)生姜青枯病菌表現(xiàn)出良好的生防潛力。這些生防菌篩選策略主要基于對(duì)病原菌的拮抗活性，雖然在篩選過程中會(huì)得到很多具有拮抗活性的生防菌株，但是受土壤復(fù)雜環(huán)境因子的影響，只有約1%的菌株能夠在盆栽試驗(yàn)中穩(wěn)定表現(xiàn)出一定的生防效果，而這個(gè)比例在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)變得更低（邱正明等，2015）。深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）是一類能夠在植物體內(nèi)生長(zhǎng)并對(duì)宿主無致病性的真菌，菌絲深色有分隔，能在植物組織細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙形成“微菌核”等定殖結(jié)構(gòu)（劉茂軍等，2009）。DSE可內(nèi)生定殖于宿主植物體內(nèi)形成互惠共生體，受外界環(huán)境影響相對(duì)較小，可望獲得更為穩(wěn)定的生防效果。越來越多的研究證實(shí)DSE在提高植物抗病性方面具有積極作用（鄧勛等，2015；Li et al.，2015；Deng et al.，2020）。目前生姜青枯病的生物防治多采用單一菌株，采用菌群或多種生防微生物降低生姜青枯病發(fā)病率的研究報(bào)道較少。汪茜等（2021，2023a）研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根真菌（AMF）與DSE共同作用能促進(jìn)盆栽和大田生姜生長(zhǎng)并提高其抗病能力。Wang等（2023）將AMF合成菌群搭配生防細(xì)菌和木霉用于生姜青枯病的田間防治試驗(yàn)，結(jié)果在連作生姜和新植生姜上應(yīng)用均取得良好的防治效果。目前，未見有DSE菌群防治生姜青枯病的研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】枝孢瓶霉屬（Cladophialophora spp.）是廣西甘蔗根圍DSE的優(yōu)勢(shì)屬（謝玲，2018），前期研究發(fā)現(xiàn)該屬菌株對(duì)同為青枯雷爾氏菌引起的番茄青枯病具有良好的防治效果，且合成菌群的防效顯著優(yōu)于單菌株（數(shù)據(jù)未發(fā)表），但該屬合成菌群對(duì)生姜青枯病的防治效果尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】以4株枝孢瓶霉屬菌株組成的合成菌群（T4）為材料，通過ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹明確供試菌株間的親緣關(guān)系，通過盆栽試驗(yàn)明確合成菌群對(duì)生姜青枯病的生防作用及生姜防御酶活性的影響，進(jìn)一步通過大田試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)生姜青枯病的防治效果，旨在為生姜青枯病生防菌劑的研制與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試生物材料枝孢瓶霉屬菌株LC3、LJ1、MS2和HX2（專利保藏編號(hào)分別為CGMCC41540、CGMCC18140、CGMCC20238和CGMCC41498）均為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害與生物防治團(tuán)隊(duì)分離自廣西甘蔗根圍土壤，保存于4℃冰箱備用。供試青枯勞爾氏菌Gg24為由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院袁高慶教授團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng)，分離自廣西桂林市臨桂區(qū)五通鎮(zhèn)黃坡生姜根際土壤，保存于4℃冰箱備用。生姜品種為桂姜290。

1.1.2供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（用于枝孢瓶霉菌株活化培養(yǎng)）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌30min。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）（用于枝孢瓶霉菌株菌絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，121℃高溫滅菌30min。LA瓊脂培養(yǎng)基（用于青枯勞爾氏菌活化培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。LB液體培養(yǎng)基（用于青枯勞爾氏菌擴(kuò)繁培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3主要儀器設(shè)備及試劑主要儀器設(shè)備：潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、霉菌培養(yǎng)箱（MJX-250BⅢ，天津市泰斯特儀器有限公司）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（HI850R，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、勻漿儀（TENLIN-C，江蘇天栩儀器有限公司）、PCR儀（PR-96E，杭州米歐儀器有限公司）。主要試劑：真菌基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司）］，2×Easy Taq?PCRSuper Mix（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化氫酶（CAT）等試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），其他化學(xué)試劑主要包括無水乙醇、氯仿、氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1合成菌群（T4）菌液制備將菌株LC3、LJ1、MS2和HX2分別接種至PDA培養(yǎng)基上活化，于28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)10d后切成細(xì)小的菌塊并接種至PDB培養(yǎng)基中，在28℃轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上培養(yǎng)10d后，用雙層滅菌紗布過濾收集菌絲體，滅菌水洗滌3次后擠干水（以手?jǐn)D壓不滴水為度），將4種菌絲體按照質(zhì)量比1∶1∶1∶1混合后用勻漿儀研磨1min，參照農(nóng)倩等（2017）的方法制備成濃度為5×105 CFU/mL的菌絲體懸浮液。

1.2.2生姜青枯菌菌液制備將病原菌Gg24用劃線法接種至LA培養(yǎng)基上活化，2 d后挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基，于30℃轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床上培養(yǎng)2 d后，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度（OD值），配成OD600 nm=1的菌液備用。

1.2.3 T4菌株間的親緣關(guān)系分析使用真菌基因組DNA提取試劑盒分別提取4株枝孢瓶霉菌株基因組DNA。以提取的DNA為模板，使用真菌通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）對(duì)ITS rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50.0μL：2×Easy Taq?PCRSuper Mix 25.0μL，上、下游引物各1.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性5 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃60 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。將所得序列上傳至NCBI，通過BLAST比對(duì)確認(rèn)4株菌株的屬級(jí)分類地位，再?gòu)腘CBI下載該屬已知物種模式菌株的ITS序列，通過MEGA 11.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。通過NCBI的BLAST比對(duì)計(jì)算菌株間的ITS相似性。按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的操作分類單元（Operational taxomomicunit，OTU），每個(gè)OTU通常被視為一個(gè)微生物物種。

1.2.4 T4對(duì)生姜青枯病的盆栽防效試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所大棚內(nèi)進(jìn)行。生姜組培苗從瓶苗經(jīng)過煉苗后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的生姜組培苗，用濃度為5×105 CFU/mL的T4菌液浸根30min后移栽到育苗基質(zhì)，以等量滅菌水浸根作為對(duì)照（CK），每盆種植1株姜苗，每重復(fù)4株苗，每處理3個(gè)重復(fù)，將盆栽生姜苗置于大棚中［溫度（30±5）℃、相對(duì)濕度（90±5）%，自然光照］。移栽80 d后測(cè)量姜苗株高，隨后每株姜苗灌根接種50 mL T4菌液，以灌根等量滅菌水為對(duì)照（CK）。灌根T4菌液14d后接種病原菌，采用直徑為0.4 mm的大頭針刺傷生姜的莖基部后，每株灌根接種100 mL Gg24菌液。分別于接種病原菌10、50和100 d后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防效。

生姜青枯病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T 1464.31—2010《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第31部分：殺菌劑防治生姜姜瘟病》。0級(jí)，全株無?。?級(jí)，10%以下的葉片輕微變黃，肉質(zhì)莖無明顯癥狀；3級(jí)，11%～30%葉片變黃，葉緣稍卷，肉質(zhì)莖出現(xiàn)水漬狀斑；5級(jí)，31%～50%葉片變黃，葉緣卷曲，植株矮化，肉質(zhì)莖部分腐爛；7級(jí)，51%以上葉片枯黃，植株萎蔫，肉質(zhì)莖大部分腐爛；9級(jí)，植株枯死，肉質(zhì)莖腐爛或僅留絲狀維管束。

發(fā)病率（%）=發(fā)病植株數(shù)/植株總數(shù)×100

病情指數(shù)=∑（各病級(jí)株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100

防效（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100

1.2.5 T4對(duì)田間生姜青枯病的防效大田試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技成果展示區(qū)進(jìn)行。生姜種苗為實(shí)生苗，起壟種植，每小區(qū)種植1壟（壟長(zhǎng)5m、壟面寬1.0 m、壟溝0.5 m），面積為75 m2，壟面生姜行距0.5 m、行內(nèi)株距0.15 m，每小區(qū)66株姜苗，每處理3次重復(fù)，田間隨機(jī)區(qū)組排列。防控生姜青枯病所用藥劑信息見表1。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，分別為對(duì)照（CK）（化學(xué)藥劑處理）：在姜苗種植28d后，用600倍20%噻菌酮、400倍20%噻唑鋅和400倍3%中生菌素混合全株噴施，每月1次，共噴施5次；處理1（生防菌劑+化學(xué)藥劑處理）：在CK處理的基礎(chǔ)上，于每次施用化學(xué)藥劑7 d后，用哈茨木霉菌枯草·貝萊斯芽孢桿菌復(fù)合菌劑3kg對(duì)水250 L全株噴施1次，每月1次，共噴施5次；處理2（T4+化學(xué)藥劑處理）：在CK處理的基礎(chǔ)上，于第1次施用化學(xué)藥劑7 d后，用稀釋10倍的5×105 CFU/mL T4菌液全株噴霧和灌根1次，共施用1次。各處理均采用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器進(jìn)行噴霧，每小區(qū)施用量為30 L。

于收獲期分別調(diào)查生姜生長(zhǎng)指標(biāo)和生姜青枯病田間自然發(fā)病情況，參照1.2.4計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。生姜植株株高為土壤表面至植株自然最高處的高度、分蘗數(shù)為包含主莖在內(nèi)的分枝總數(shù)、株幅為整個(gè)株叢垂直投影的最大寬度、根狀塊莖長(zhǎng)度為根狀塊莖的最大長(zhǎng)度、生物學(xué)產(chǎn)量為生姜整株根莖葉的總重量、經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量為生姜根狀塊莖的重量。

1.2.6 T4對(duì)生姜防御酶活性的影響在1.2.4盆栽試驗(yàn)中，于病原菌接種后第2 d，各處理每個(gè)重復(fù)選取具有代表性生姜1株，用消毒好的剪刀從莖基部剪下，去除葉子，將地上莖剪成2 cm的小段，混合后用錫紙包好置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照相?yīng)試劑盒的檢測(cè)方法，測(cè)定生姜過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化氫酶（CAT）、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 8作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 T4菌株間親緣關(guān)系分析結(jié)果

以Cyphellophora reptans為外群，基于枝孢瓶霉屬ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖1）顯示，菌株LC3以95%的支持率與Cladophialophora immunda的模式菌株CBS834.96聚在一個(gè)進(jìn)化枝上，二者間的ITS相似性為98.11%，鑒定為同一個(gè)物種；菌株HX2單獨(dú)位于一個(gè)進(jìn)化枝上，為本研究團(tuán)隊(duì)最近發(fā)表的新種Cladophialophora guangxiense。菌株LJ1和MS2的ITS序列相似性為98.12%，二者相似性高于97%，鑒定為同一物種；菌株LJ1和MS2以89%的支持率在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚成一個(gè)小的進(jìn)化枝，并與Cladophialophora laricicola CBS148944和Cladophialophora lichenis CGMCC3.20424 2株模式菌構(gòu)成的進(jìn)化枝形成姐妹群關(guān)系，但支持率低于50%，說明菌株LJ1和MS2與已知種的親緣關(guān)系并不穩(wěn)定，證明菌株LJ1和MS2是一個(gè)疑似新種Clado-phialophora nov.sp.1。可見，用于本研究的菌株HX2、LJ1與MS2從ITS序列上是2個(gè)新物種，2個(gè)物種間的ITS相似性為90.89%～91.52%。

2.2 T4對(duì)生姜青枯病的盆栽防效

盆栽生姜苗灌根接種病原菌后，CK處理第3～4 d開始發(fā)病，T4處理第9～10 d開始發(fā)病，T4處理可延遲6 d發(fā)病。接種病原菌7 d后，CK處理的生姜表現(xiàn)出典型的青枯病癥狀，葉片無光澤，逐漸凋萎變黃，邊緣卷曲，最后枯死，地上莖呈暗紫色，內(nèi)部組織變褐、腐爛，而T4處理生姜無明顯癥狀；接種病原菌10 d后2個(gè)處理的生姜均發(fā)病。生姜組培苗經(jīng)T4菌液浸根處理移栽80 d后，平均株高較對(duì)照極顯著提高58.5%（Plt;0.01，下同）（圖2-A）。接種病原菌10、50和100 d后的調(diào)查結(jié)果顯示，CK處理的病情指數(shù)隨時(shí)間推移一直處于上升趨勢(shì)，而T4處理的病情指數(shù)在各調(diào)查時(shí)間點(diǎn)均低于CK，呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，與CK相比有顯著差異（Plt;0.05，下同）上升為極顯著差異（圖2-B）。T4處理對(duì)生姜青枯病的防效隨時(shí)間推移呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在接種病原菌100 d時(shí)的防效為51.5%（圖2-C）。CK處理的生姜青枯病發(fā)病率在接種病原菌50 d達(dá)100.0%后基本保持不變，而T4處理的發(fā)病率則隨時(shí)間推移呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在接種病原菌100 d時(shí)較CK降低22.2%（圖2-D）。CK處理整株枯死的生姜植株高達(dá)55.6%，且枯死后不能重新長(zhǎng)出新苗，而T4處理有44.0%的植株整株枯死，其中有50.0%的植株可以重新長(zhǎng)出新苗，最終枯死率降至22.0%，顯著低于CK（圖3）?？梢?，T4對(duì)生姜青枯病具有較好的防病和治療作用。

2.3 T4對(duì)田間生姜青枯病發(fā)生的影響

2.3.1 T4對(duì)田間生姜青枯病發(fā)病情況的影響調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，在田間自然發(fā)病情況下，各處理的發(fā)病率排序?yàn)樘幚?lt;處理1lt;CK，病情指數(shù)排序?yàn)樘幚?lt;CKlt;處理1，處理2的發(fā)病率和病情指數(shù)均最低，分別為73.30%和16.05，極顯著低于處理1和CK。處理2較CK發(fā)病率降低25.0%、病情指數(shù)降低68.6%。從田間發(fā)病狀況來看，處理1大面積植株發(fā)病，發(fā)病嚴(yán)重程度與CK無明顯差異，病株一旦發(fā)病很難再恢復(fù)正常生長(zhǎng)；而處理2病情較輕，整體長(zhǎng)勢(shì)較好，植株葉片呈青綠色，根莖健壯，有的病株發(fā)病后期還能恢復(fù)正常生長(zhǎng)（圖4）。

2.3.2 T4對(duì)田間生姜生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響由圖5可看出，正常栽培管理6個(gè)月后，與其他處理相比，處理2的生姜分蘗數(shù)、株輻、根狀塊莖長(zhǎng)度、生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量等均最高，分別較CK極顯著增加50.4%、12.8%、36.4%、50.0%和55.6%。處理1除分蘗數(shù)與CK相當(dāng)外，株輻、根狀塊莖長(zhǎng)度、生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量均顯著高于CK，其中根狀塊莖高度達(dá)極顯著差異水平。處理2的生姜分蘗數(shù)、株輻、根狀塊莖長(zhǎng)度、生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量均顯著高于處理1，其中分蘗數(shù)和根狀塊莖長(zhǎng)度達(dá)極顯著差異水平。從生姜長(zhǎng)勢(shì)來看，與CK和處理1相比，處理2的分枝和根須增多，葉片更茂盛，姜塊肥大，降低產(chǎn)量損失效果明顯（圖6）。

2.4 T4對(duì)生姜防御酶活性的影響

T4處理對(duì)生姜植株的防御酶活性均產(chǎn)生了一定影響，在病原脅迫下，與CK處理相比，生姜的POD活性提高31.2%、SOD活性提高25.1%、PPO活性提高10.9%、CAT活性提高7.1%、病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性分別提高12.2%和32.1%（表3），均達(dá)到顯著或極顯著差異水平。

3討論

枝孢瓶霉是DSE的優(yōu)勢(shì)種，其寄主范圍廣，在全球各種生境中廣泛分布（謝玲，2018；姚凱，2020；Netherway et al.，2024），分布的廣泛性說明該類真菌對(duì)各種生境具有良好的適應(yīng)性。有研究發(fā)現(xiàn)，枝孢瓶霉菌株Cladophialophora chaetospira SK51能與草莓植株互惠共生，顯著促進(jìn)莖和根干質(zhì)量、葉綠素含量和果實(shí)數(shù)量等的提高，對(duì)枯萎病具有良好的生防作用（Harsonowati etal.，2020）。在本研究中，菌株HX2為本課題組近期發(fā)表的新物種Cladophia-lophora guangxiense（Wei et al.，2024），菌株LJ1和MS2同屬于1個(gè)疑似新種，而菌株LC3為在前人研究中具有特殊的醫(yī)學(xué)和環(huán)境修復(fù)意義的Cladophia-lophoraimmunda（Blasi et al.，2017），4株菌株間無拮抗作用，其復(fù)合菌群T4在室內(nèi)盆栽條件下能推遲生姜青枯病發(fā)病時(shí)間，病情指數(shù)也顯著降低，并呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，與大田試驗(yàn)中觀察到的病株后期還能一定程度上恢復(fù)正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出良好的治療修復(fù)作用相互印證。目前，未見有關(guān)枝孢瓶霉與生姜互作的研究報(bào)道，本研究首次報(bào)道了枝孢瓶霉在生姜防病方面所起的積極作用。

已有研究證明幾種微生物菌株組合產(chǎn)生的促生抗病效果明顯優(yōu)于單菌株。劉貴猛等（2017）篩選到適宜生姜生長(zhǎng)的優(yōu)良AMF地表球囊霉（Glomus ver-siforme）和植物根圍促生細(xì)菌（PGPR）假單胞菌（Pseudomonus sp.）S3-11菌株組合，二者組合能相互促進(jìn)，協(xié)同抑制生姜青枯病菌，誘導(dǎo)生姜抗病性，促進(jìn)生姜生長(zhǎng)和增加產(chǎn)量；申鴻等（2018）將3種不同的植物促生菌（PGPB）菌株進(jìn)行復(fù)配后應(yīng)用于生姜種苗盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌對(duì)生姜具有良好的促生效應(yīng)，顯著提高種苗分蘗數(shù)、葉面積和地下部干質(zhì)量；汪茜等（2021，2023a）發(fā)現(xiàn)AMF單菌株和DSE單菌株復(fù)配施用對(duì)生姜的促生和青枯病的抗病效果明顯優(yōu)于二者的單菌株處理。本研究結(jié)果顯示，枝孢瓶霉合成菌群相對(duì)于本課題組前期的單菌株試驗(yàn)結(jié)果對(duì)生姜青枯病的防效更明顯，也與前人的研究結(jié)果一致，可能是由于不同菌株在產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗病物質(zhì)方面水平不同，菌株組合可以協(xié)同發(fā)揮其各自機(jī)制作用，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)綜合提高對(duì)植物的促生防病能力。

生防菌的定殖能力是決定生防效果的關(guān)鍵因素之一，許多生防菌株在大田試驗(yàn)中抗病效果不穩(wěn)定，這主要與菌株的定殖能力、外界環(huán)境和競(jìng)爭(zhēng)作用相關(guān)（李青等，2023；宋露洋等，2024）。而生防菌與殺菌劑的兼容問題在生防領(lǐng)域是不可回避的問題，為此不少學(xué)者研究了生防菌與殺菌劑的協(xié)同作用效果（劉暢等，2024；王文肖等，2024；尹向田等，2024）。本研究也在田間試驗(yàn)中探討了不同生防菌與殺菌劑的兼容效果，枝孢瓶霉合成菌群菌液僅需在苗期施用1次，其協(xié)同抗病效果極顯著優(yōu)于施用5次的哈茨木霉菌枯草·貝萊斯芽孢桿菌復(fù)合菌劑，可能與接種的DSE菌群為內(nèi)生真菌，可定殖于宿主植物體內(nèi)建立互惠共生體，且受外界環(huán)境的影響相對(duì)較小有關(guān)，也說明DSE可通過苗期接種一次全程保護(hù)作物健康。大多數(shù)木霉和芽孢桿菌主要依靠其產(chǎn)生具有殺菌功能的活性成分以及其自身與病原菌的競(jìng)爭(zhēng)能力抑制病原菌（李歆建等，2024；邱一埔等，2024；王輝等，2024），生防菌本身的生長(zhǎng)狀況決定了其生防能力，而本研究中用到的殺菌劑具有殺細(xì)菌活性，對(duì)該復(fù)合菌劑中的芽孢桿菌具有同等的殺傷作用，因此在生防菌劑與殺菌劑配合使用時(shí)，要選擇對(duì)生防菌無抑制作用的殺菌劑。殺菌劑與生防菌相結(jié)合，既能利用殺菌劑對(duì)抗生姜青枯病發(fā)病急且快的問題，從而回避生防菌劑見效慢的弊端；反過來生防菌的加入能提高土壤中潛在益生菌如酸桿菌（Acidobac-teria）和雙胞菌（Gemmatimonadetes）等的豐度，有利于優(yōu)化土壤微生態(tài)平衡（Wang et al.，2023），從而調(diào)節(jié)化學(xué)殺菌劑對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的不利影響。利用枝孢瓶霉合成菌群結(jié)合殺菌劑防控生姜青枯病，可為生姜青枯病的生物防治提供新途徑。

邱美莎等（2022）發(fā)現(xiàn)DSE菌株X22對(duì)香蕉枯萎病具有良好的生防效果，但生防菌株X22并未分泌抗生物質(zhì)，對(duì)病原菌無直接的拮抗作用，其多糖和寡聚糖提取物對(duì)香蕉苗表現(xiàn)出良好的促生抗病作用，說明該菌株的生防機(jī)理之一是誘導(dǎo)抗性。本研究中，在病原菌入侵時(shí)，枝孢瓶霉合成菌群T4可激發(fā)生姜防御酶（POD、SOD、PPO、CAT、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶）活性顯著或極顯著提高，增強(qiáng)植株的抗病性，說明其生防機(jī)理可能與誘導(dǎo)抗性相關(guān)，但具體原因仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。目前，枝孢瓶霉合成菌群共同侵染定殖于生姜根系所形成的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、土壤的微生物群落、理化性質(zhì)和酶活性等尚不明確，后續(xù)需進(jìn)一步研究。同時(shí)，綜合防治對(duì)象的發(fā)病規(guī)律、栽培技術(shù)和使用成本等因素，將枝孢瓶霉合成菌群制成易保存、運(yùn)輸便捷和貨架期長(zhǎng)的菌劑是未來值得進(jìn)行深入探究的方向。

4結(jié)論

枝孢瓶霉合成菌群T4可提高生姜防御酶活性，增強(qiáng)植株的抗病性，推遲青枯病發(fā)病時(shí)間，顯著降低生姜青枯病的病情指數(shù)、發(fā)病率及產(chǎn)量損失，具有良好的防病和治療修復(fù)作用。枝孢瓶霉合成菌群T4可與殺菌劑配合使用，在生姜青枯病的生物防治方面具有良好的開發(fā)利用前景。

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（責(zé)任編輯：麻小燕）