當歸補血湯調控中性粒細胞胞外誘捕網改善卵巢早衰大鼠骨質疏松的機制研究

中圖分類號 R965；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）06-0655-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.06.03

摘要 目的 探討當歸補血湯調控中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）改善卵巢早衰（POF）大鼠骨質疏松（OP）的機制。方法 將雌性SD大鼠隨機分成正常組、模型組、骨化三醇組及當歸補血湯低、中、高劑量組，每組9 只。除正常組外，其余各組大鼠于第1、8 天以6 mg/kg 的劑量腹腔注射順鉑溶液建立POF并發OP模型。從造模第5 天開始，各組大鼠灌胃相應藥液或生理鹽水，每天1 次，連續4 周。末次給藥后，檢測各組大鼠血清中雌二醇（E2）、NETs、25-羥維生素D3[25（OH）D3]、核因子κB 受體激活蛋白配體（RANKL）、骨鈣蛋白（BGP）水平，觀察其骨組織病理學改變，并檢測其骨組織中維生素D受體（VDR）、髓過氧化物酶（MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、瓜氨酸化組蛋白H3（CitH3）、25 羥基維生素D-1α-羥化酶（CYP27B1）、1α，25-二羥維生素D3-24-羥化酶（CYP24A1）蛋白的表達情況。結果 與正常組相比，模型組大鼠骨組織骨小梁數量減少、變細及斷裂且連接不完整，網狀結構明顯受損，骨髓腔增大；血清中NETs、RANKL水平和骨組織中MPO、NE、CitH3、CYP24A1 蛋白的表達均顯著升高或上調，血清中E2、25（OH）D3、BGP水平和骨組織中VDR、CYP27B1 蛋白的表達均顯著降低或下調（P＜0.05）。與模型組相比，各藥物組大鼠骨組織病理學改變均有所恢復，多數定量指標顯著改善（P＜0.05）。結論 當歸補血湯能夠恢復POF 并發OP大鼠的E2水平，改善OP，其機制可能與上調VD水平、抑制NETs 形成有關。

關鍵詞 當歸補血湯；卵巢早衰；骨質疏松；中性粒細胞胞外誘捕網；維生素D

骨質疏松（osteoporosis，OP）是一種因骨形成與骨吸收失衡而導致的代謝性疾病，表現為骨量減少和骨微結構受損，可使患者骨折風險增加[1]。卵巢早衰（prematureovarian failure，POF）是指女性在40 歲前卵巢功能異常衰退，主要特征是雌激素水平顯著降低而促性腺激素水平異常升高，表現為閉經、不孕等癥狀，嚴重影響女性生育和整體健康[2]。研究指出，卵巢功能衰退引起的雌激素水平顯著下降會導致骨形成與骨吸收平衡失調，加速骨質受損和骨量流失，促進OP的發生發展[3]；此外，炎癥反應也是OP 的重要致病因素之一，可通過影響骨骼系統來干擾成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，從而導致骨量流失[4]。中性粒細胞在炎癥反應中會釋放一種特殊的網狀結構，即中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellulartraps，NETs），其由DNA、組蛋白、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）等成分構成，能夠捕獲并消滅病原微生物，是先天性免疫系統的重要胞外防御屏障[5]。然而，若NETs 過度活化或長期存在則可能會對機體產生負面影響，上述過程伴隨大量炎癥介質的釋放，可激活破骨細胞、增加骨吸收，從而破壞骨代謝平衡，導致骨量流失[4，6]。維生素D（vitamin D，VD）作為關鍵的免疫調節因子，不僅可通過促進鈣、磷吸收來維持骨骼健康，而且能通過降低MPO、NE、瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinatedhistone H3，CitH3）水平來抑制NETs 生成，在多種炎癥性疾病的治療中具有重要作用[7－8]。

當歸補血湯源于李東垣的《內外傷辨惑論》，由當歸、黃芪組方而成，具有補氣生血之效。本課題組前期研究發現，當歸補血湯能有效降低POF大鼠血清促卵泡激素和促黃體生成素水平，提升血清雌二醇（estradiol，E2）和抗米勒管激素水平；同時，該方還可恢復OP 大鼠骨小梁結構，并通過抑制VD限速酶1α，25-二羥維生素D3-24-羥化酶（又稱CYP24A1）的表達、維持體內VD水平來降低骨鈣蛋白（osteocalcin，又稱BGP）的表達，從而改善POF和OP[9－10]。基于此，本研究通過建立POF并發OP大鼠模型，擬從VD調控NETs 的角度出發，探討當歸補血湯改善POF 大鼠OP的作用機制，以期為當歸補血湯的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BX53 型正置顯微鏡（日本Olympus 公司）、Multiskan MK3 型全自動酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、DYCZ-24DN 型垂直電泳槽（北京六一生物科技有限公司）、ChemiDoc 型化學發光凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）、RM 2016 型轉輪式切片機（德國Leica公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

當歸、黃芪飲片（產地均為甘肅，批號分別為20230301、20231101）均購自北京同仁堂貴陽藥店有限公司，由貴州中醫藥大學基礎醫學院方劑學教研室蔣志濱副教授鑒定均為真品。

骨化三醇軟膠囊（批號2110051，規格0.25 μg）購自青島正大制藥有限公司；順鉑對照品（批號HY-17394，純度99.70%）購自美國MCE 公司；免疫組化顯色試劑盒（批號K5007）購自美國Agilent 公司；E2、核因子κB受體激活蛋白配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、NETs、25-羥維生素D3[25（OH）D3]、BGP酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為JM-01981R1、JM-01911R1、JM-10980R1、JM-01918R1、JM-02028R1）均購自江蘇晶美生物科技有限公司；鼠抗維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）抗體、兔抗MPO抗體、兔抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號分別為67192-1-Ig、22225-1-AP、20536-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗25- 羥基維生素D-1α - 羥化酶（又稱CYP27B1）抗體、兔抗CYP24A1 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G 二抗（批號分別為A1716、A1805、AS014）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗NE 抗體（批號AF0010）購自美國Affinity公司；兔抗CitH3 抗體（批號NB100-57135）購自美國Novus Biologicals 公司；HRP 標記的羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗（批號BS12478）購自美國Bioworld Technology公司。

1.3 實驗動物

SPF 級雌性SD大鼠54 只，體重190～210 g，8～9 周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司[動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010]。大鼠均飼養于溫度、濕度適宜的動物房內，自由攝食、飲水。本實驗已獲得貴州中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準（倫理號20230100）。

2 方法

2.1 藥液的配制

根據《內外傷辨惑論》原文記載的組方藥材用量“黃芪一兩，當歸二錢”（即兩者質量比5∶1）稱取黃芪60 g、當歸12 g，混合，以水浸泡1 h 后，煎煮30 min×2 次；合并煎煮液，濃縮，得質量濃度為0.72 g/mL（以生藥量計）的當歸補血湯藥液。取骨化三醇膠囊內容物，以橄欖油為溶劑，制得質量濃度為0.025 μg/mL 的骨化三醇藥液，備用。取順鉑對照品適量，以生理鹽水為溶劑，制得質量濃度為1 mg/mL的順鉑溶液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

將所有大鼠適應性喂養7 d 后隨機分為正常組、模型組、骨化三醇組（0.1 μg/kg）及當歸補血湯低、中、高劑量組（1.8、3.6、7.2 g/kg，以生藥量計，劑量參考本課題組前期研究設置[11]），每組9 只。除正常組外，其余各組大鼠均參考相關文獻[12]的方法于第1、8 天以6 mg/kg 的劑量腹腔注射順鉑溶液以建立POF并發OP模型。從造模（順鉑首次注射時，下同）第5 天開始，給予骨化三醇組及當歸補血湯各劑量組大鼠灌胃相應藥液，正常組及模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，連續4 周。

2.3 大鼠動情周期變化觀察

自造模第1 天起，每組隨機選取3 只大鼠進行標記，于每天上午9 點進行陰道脫落細胞涂片檢查，觀察大鼠在整個造模期間的動情周期變化：抓取大鼠，暴露陰道，輕柔地將經生理鹽水浸潤的無菌棉簽插入其陰道，旋轉2～3 圈以刮取陰道分泌物；將分泌物均勻涂抹在載玻片上，用0.1% 亞甲基藍染色液染色，隨后使用顯微鏡觀察并拍照。根據觀察到的細胞類型和數量，判斷大鼠所處的動情階段——若存在有核上皮細胞且偶見無核角化細胞，記為動情前期；若主要為無核角化細胞，記為動情期；若同時可見白細胞、無核角化細胞、有核上皮細胞，記為動情后期；若為大量白細胞伴少量角化細胞，記為動情間期[13]。如果大鼠在整個觀察期內持續處于某一時期，則判斷其動情周期出現了紊亂，提示POF 模型建立成功。

2.4 標本采集與處理

末次給藥后，所有大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，從腹主動脈采集血樣，靜置2 h 后以3 000 r/min 離心15 min，得到上層血清，分裝后于－80 ℃下保存，備用。采血后，以頸椎脫臼法將大鼠處死，迅速收集其兩側股骨并剝離軟組織。將左側股骨組織放入4% 多聚甲醛溶液中固定保存，右側股骨組織則于－80 ℃下保存，備用。

2.5 大鼠血清E2、NETs、25（OH）D3、RANKL、BGP 水平檢測

取“2.4”項下凍存的各組大鼠（每組隨機選取6 只）的血清樣品，嚴格按照相應試劑盒說明書操作，采用ELISA 法以酶標儀檢測其血清E2、NETs、25（OH）D3、RANKL、BGP水平。

2.6 大鼠骨組織病理變化觀察

取“2.4”項下經4% 多聚甲醛溶液固定的各組大鼠（每組隨機選取3 只）股骨組織樣本，放入15% 乙二胺四乙酸脫鈣液中行脫鈣處理；確保骨質軟化后，進行梯度乙醇脫水、常規石蠟包埋后切片；取切片，依次進行蘇木精、伊紅染色，再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，以中性樹膠封片，使用顯微鏡觀察其骨組織病理變化。

2.7 大鼠骨組織中VDR、MPO、NE、CitH3 蛋白陽性表達檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.6”項下各組大鼠的骨組織切片，經梯度乙醇脫水后，滴加0.01 mmol/L Tris-乙二胺四乙酸修復液（pH9.0），孵育15 min；以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后，滴加3% 過氧化氫以阻斷內源性過氧化物酶，于室溫下靜置15 min；以PBS再次漂洗后，加入山羊血清于37 ℃下孵育30 min；滴加VDR、MPO、NE、CitH3 一抗（稀釋比例均為1∶100），在4 ℃下孵育過夜；以PBS 漂洗后，滴加適量二抗（即免疫組化顯色試劑中的A液），室溫孵育30 min；以PBS 漂洗后，滴加DAB顯色液顯色，再以蘇木精復染10 s，用梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，以中性樹膠封片，使用顯微鏡觀察并采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對上述蛋白陽性表達區域（呈黃褐色或棕黃色）進行光密度分析，用以反映其表達水平。

2.8 大鼠骨組織中VDR、CYP27B1、CYP24A1、MPO、NE蛋白表達檢測

采用Western blot 法檢測。取“2.4”項下凍存的各組大鼠（每組隨機選取3 只）股骨組織樣本，研磨，置于含有組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑的1.5 mL 微量離心管中，勻漿，在冰上裂解30 min，再以14 000 r/min 離心15min，收集上清液，并使用BCA 法測定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入5×loading buffer 適量，在95 ℃下加熱15min 使蛋白變性。取適量變性蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉膜，用5% 牛血清白蛋白溶液封閉1 h；棄去封閉液，加入VDR、CYP27B1、CYP24A1、MPO、NE、β-actin 一抗（稀釋比例分別為1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000），在4 ℃下孵育過夜；以TBST 緩沖液洗膜后，加入相應二抗[稀釋比例分別為1∶2 000（羊抗兔）、1∶5 000（羊抗鼠）]，在室溫下孵育1 h；以TBST 緩沖液洗膜后，使用化學發光試劑進行顯影，并置于化學發光凝膠成像儀下成像。使用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目的蛋白的表達水平，結果以正常組為參照進行歸一化處理。

2.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對數據進行統計分析。對于符合正態分布的數據，采用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析（方差齊）或Welch 方差分析（方差不齊），進一步兩兩比較采用Tukey’s 事后檢驗（方差齊）或Tamhane’s T2 事后檢驗（方差不齊）。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠動情周期變化

正常組大鼠動情前期、動情期、動情后期、動情間期循環可見，動情周期正常（圖1）。與正常組比較，其余各組大鼠動情周期紊亂，多數處于動情前期，甚至未見完整的動情周期，表明大鼠卵巢受損，其功能受到抑制，提示POF模型復制成功。

3.2 當歸補血湯對模型大鼠血清E2、NETs、25（OH）D3、RANKL、BGP水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清NETs、RANKL 水平均顯著升高，而E2、25（OH）D3、BGP 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，骨化三醇組、當歸補血湯各劑量組大鼠血清NETs 水平以及骨化三醇組、當歸補血湯高劑量組大鼠血清RANKL水平均顯著降低，骨化三醇組、當歸補血湯各劑量組大鼠血清E2、25（OH）D3、BGP水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

3.3 當歸補血湯對模型大鼠骨組織病理特征的影響

正常組大鼠骨組織結構清晰，骨小梁排列緊密，骨干部位骨組織完整、連續，骨髓腔內可見豐富的骨髓細胞。相比之下，模型組大鼠骨組織內可見骨小梁數量減少、變細、斷裂且連接不完整；網狀結構明顯受損，骨髓腔增大且融合明顯，并伴有脂肪細胞增多。與模型組相比，骨化三醇組和當歸補血湯各劑量組大鼠骨組織的上述病理改變均有不同程度恢復。結果見圖2。

3.4 當歸補血湯對模型大鼠骨組織中VDR、MPO、NE、CitH3蛋白陽性表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠骨組織中VDR蛋白陽性表達顯著減少，MPO、NE、CitH3 蛋白陽性表達顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，骨化三醇組、當歸補血湯各劑量組大鼠骨組織中VDR 蛋白陽性表達均顯著增加，MPO、NE、CitH3 蛋白陽性表達均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3（以VDR蛋白為例）、表2。

3.5 當歸補血湯對模型大鼠骨組織中VDR、CYP27B1、CYP24A1、MPO、NE蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠骨組織中VDR、CYP27B1 蛋白的表達均顯著下調，而CYP24A1、MPO、NE 蛋白的表達則顯著上調（P＜0.05）；與模型組比較，骨化三醇組、當歸補血湯各劑量組大鼠骨組織中VDR、CYP27B1 蛋白的表達均顯著上調，而CYP24A1、MPO、NE 蛋白的表達均顯著下調（P＜0.05）。結果見圖4、表3。

4 討論

破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成是骨代謝的基本過程，正常狀態下兩者保持著動態平衡的狀態。POF具有低雌激素水平的特征，雌激素水平異常降低可促使骨細胞凋亡，凋亡的骨細胞可引起RANKL表達上調，從而使破骨細胞活性有所增強，而成骨細胞功能受到抑制，導致骨吸收大于骨形成，最終引發骨量流失[14－15]。BGP由成骨細胞合成后釋放入血，其水平高低反映了成骨細胞的活動狀態與骨更新的速率[16]。研究表明，當歸補血湯能有效調節體內骨代謝平衡，修復骨小梁破碎情況，對OP 具有顯著的改善作用[17]。本研究通過觀察大鼠骨組織切片發現，與正常組相比，模型組大鼠骨小梁數量減少，甚至變細、斷裂，網狀結構明顯受損，骨髓腔增大且融合明顯，符合OP的經典病理表現；用骨化三醇及當歸補血湯干預后，大鼠骨組織中骨小梁數量增多、結構完整，網狀結構明顯恢復，表明骨化三醇和當歸補血湯對OP 均有改善作用。此外，低、中、高劑量當歸補血湯均能顯著升高模型組大鼠血清E2和BGP水平，并且高劑量當歸補血湯能顯著降低血清RANKL水平，提示其對OP的改善作用可能是通過恢復雌激素水平，調節RANKL介導的成骨細胞和破骨細胞分化，加速骨形成而實現的。然而，低、中劑量當歸補血湯對RANKL水平的影響并無統計學意義，故其量效關系尚有待進一步探索。

炎癥是引起OP 的重要因素之一，與骨生成和骨吸收失衡密切相關[5]。NETs 是中性粒細胞受到炎癥刺激時所釋放的網狀結構，依賴肽酰基精氨酸脫亞氨酶4（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）活化及組蛋白H3瓜氨酸化形成[18]。其中，組蛋白H3 瓜氨酸化的產物CitH3 是NETs 的標志物之一，可參與調節炎癥的發生及嚴重程度[18]。研究指出，NETs 可顯著抑制RANKL介導的破骨細胞分化，從而參與骨穩態的調節[19]；而使用PAD4 抑制劑則可顯著減少NETs 的形成，進而減弱RANKL 誘導的破骨細胞生成和骨侵蝕[20]。研究表明，NETs 的主要成分MPO可通過調節活性氧水平來抑制破骨細胞分化和骨吸收，而敲除MPO編碼基因則可導致小鼠OP 表型增加、骨吸收增強[21]；NE 可通過降解骨保護素來促進由VD3誘導的破骨細胞分化，參與炎癥部位破骨細胞的生成和骨吸收[22]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清NETs 水平及骨組織中CitH3、MPO、NE蛋白的表達水平均顯著高于正常組；經當歸補血湯干預后，上述指標的表達受到顯著抑制，提示當歸補血湯均能夠減少NETs 形成，這可能是該方改善OP的潛在機制。

VD是一種脂溶性類固醇激素，有VD2和VD3兩種主要形式。人體所需的VD3主要借助紫外線照射在皮膚內合成，在體內經25-羥化酶羥化為25（OH）D3，后經CYP27B1 作用合成為活性形式的1，25-二羥維生素D3，后者通過結合靶器官中的VDR 來發揮生物學效應[23]。血清25（OH）D3水平是評價體內VD水平的主要指標，已被證實其可促進鈣鹽沉積、骨小梁再生，其水平降低可導致骨質中硫酸鹽、碳酸鹽沉積減少，從而誘發骨量流失[24]。研究指出，OP 患者普遍處于低25（OH）D3狀態，補充25（OH）D3能夠有效提升骨密度，具有良好的臨床應用效果[25]。CYP24A1 編碼基因是對1，25-二羥維生素D3轉錄反應最強的基因，參與1，25-二羥維生素D3的代謝失活，從而維持1，25-二羥維生素D3 的生理水平[26]。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清25（OH）D3水平及骨組織中VDR、CYP27B1 蛋白表達水平顯著降低，CYP24A1 蛋白表達水平顯著上升；經當歸補血湯干預后，大鼠血清25（OH）D3水平及骨組織中VDR、CYP27B1 蛋白表達水平均顯著升高，而CYP24A1 蛋白表達水平顯著降低，表明該方具有調控VD表達的作用。

綜上所述，當歸補血湯能夠恢復POF 并發OP 大鼠的E2水平，改善OP，其機制可能與上調VD 水平、抑制NETs 形成有關。

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（收稿日期：2024-07-29 修回日期：2024-11-15）

（編輯：張元媛）