4 種檢測方法對結核病的診斷價值

蘭小英，盧榕（通信作者），練明建

廈門大學附屬第一醫院檢驗科·廈門市基因檢測重點實驗室 （福建廈門 361003）

結核病為結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的慢性傳染性疾病，位列全球十大死因之中，同時也是單一傳染病中的“頭號殺手”[1]。據《全球結核病報告》顯示，2018年約有1 000萬新發結核病患者，其中57%為成年男性，我國的結核病發病率居世界第二[2]。人體感染MTB初期，無明顯臨床表現，當機體免疫力低下或變態反應增高時會發展為活動性結核病，給患者及其家屬身心帶來嚴重傷害[3]。因此，早期診斷并及時有效治療結核病是降低我國結核病發病率的關鍵[4]。目前，如何快速、準確診斷結核病成了研究的熱點。本研究將比較結核菌素（purified protein derivative，PPD）試驗、結核感染T細胞斑點試驗（T-cell spot test for tuberculosis infection，T-SPOT.TB）、結核分枝桿菌抗體（mycobacterium tuberculosis antibody，TB-Ab）檢測和抗酸染色涂片（acid-fast smear，AFS）4種檢測方法對結核病診斷的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年12月我院收治的326例患者為研究對象，其中結核病患者198例，非結核病患者128例。本研究獲醫院醫學倫理委員會審批，經患者知情同意并簽署知情同意書。所有確診結核病患者均根據既往病史、臨床癥狀和體征、影像學檢查及抗結核治療有效而確診，結核感染確診根據我國衛生行業標準（WS 196-2017）[5]。

1.2 方法

PPD試驗：于左前臂掌側前1/3無瘢痕處皮內注射5 IU PPD，經72 h（48～96 h）測量皮膚硬結直徑。判讀標準：陰性（-），硬結平均直徑＜5 mm或無反應；弱陽性（+），5 mm≤硬結平均直徑＜10 mm；中度陽性（2+），10 mm≤硬結平均直徑＜15 mm；強陽性（3+），硬結平均直徑≥15 mm或局部出現劇烈紅腫、雙圈、水泡、組織壞死及淋巴管炎。

T-SPOT.TB：按照T-SPOT.TB試劑盒說明書操作，該實驗采用免疫印跡的方法，將采集好的5 ml肝素抗凝外周靜脈血，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），洗滌，記數PBMCs；然后分別將50 μl陰性對照細胞培養液、陽性對照植物血凝素、A抗原早期分泌性靶抗原6（6 kDa early secretary antigenic target，ESAT-6）及B抗原濾液培養蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）加入已包被有抗干擾素-γ（interferongamma，IFN-γ）抗體的微量板4個孔中，每孔再加入100 μl PBMCs，同時置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育16～20 h；磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 洗滌，再加入50 μl底物工作液37 ℃孵育2～3 h，采用斑點計數儀自動計數斑點數。判斷標準：要求陰性對照孔斑點數≤5個，陽性對照孔斑點數≥20個，當檢測孔斑點數-陰性對照孔斑點數≥5個時，結果判定為陽性。

TB-Ab 檢測：按標準操作規程將質控品和檢測試劑預先平衡至室溫，在質控孔和檢測孔上依次加入封閉液、40 μl 新鮮的血清、6滴洗滌液、2滴金標液、6滴洗滌液，每次滴入后等待薄膜吸入，最后觀察結果。判斷標準：陰性，質控點顯示紅色，反應孔中間無紅色斑點或僅為痕跡；陽性，質控點顯示紅色，反應孔中間有紅色斑點出現。

AFS：按照涂片、固定、抗酸染色的步驟制作玻片，顯微鏡下觀察結果，抗酸桿菌具有耐受酸性介質脫色的生物特性，石碳酸（苯酚）和復紅將抗酸桿菌染色后，加入3%鹽酸乙醇脫色，標本中的非抗酸菌及其他脫落細胞被復染劑亞甲藍染為藍色，抗酸桿菌在顯微鏡下保持紅色。判斷標準：抗酸桿菌陰性，連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌；抗酸桿菌陽性（1+），3～9條/100視野，連續觀察300個視野；（2+），1～9條/10視野，連續觀察100個視野；（3+），1～9條/1視野；（4+），≥10條/1視野。

1.3 評價指標

比較PPD 試驗、T-SPOT.TB、TB-Ab 檢測和AFS 4種檢測方法的靈敏度和特異度，靈敏度=結核病患者陽性例數/結核病患者總例數×100%，特異度=非結核病患者陰性例數/非結核病患者總例數×100%。

1.4 統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據處理，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

T-SPOT.TB 與其他3種檢測方法相比，靈敏度最高，特異度最低；AFS 與其他3種檢測方法相比，特異度最高，靈敏度最低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 4種檢測方法在結核病患者和非結核病患者中的靈敏度、特異度比較

3 討論

結核病是嚴重危害人類健康的傳染性疾病，近年來，隨著環境污染的加劇和艾滋病的傳播，結核病的發病率呈明顯升高趨勢，且高耐藥性結核病患者的數量不斷增加，對潛伏性結核病患者的早期診斷和及時治療成為控制結核病的重要措施。AFS 具有操作簡單快捷、價格低廉等優勢，在實際工作中運用廣泛。Lee 等[6]研究結果顯示，在活動性肺結核病診斷中，AFS 的特異度高達100.00%。本研究結果顯示，AFS 與其他3種檢測方法相比，特異度最高，與上述研究結果相似。但是，AFS 的靈敏度較低，易漏診，這可能與部分患者留痰困難、標本留取不合格有關。

PPD 試驗以MTB 純蛋白衍生物為抗原，在左前臂掌側前1/3中央皮內注射， 48～72 h 后注射部位會出現皮膚硬結，根據硬結的平均直徑來判斷結果，價格低廉、操作簡單方便，被廣泛應用于臨床。本研究結果顯示，PPD 試驗的靈敏度為54.55%，特異度為78.13%，其他3種檢測方法相比，結果較為居中，可以作為潛伏性感染者的篩查方法。需要注意的是，將其應用于免疫抑制劑、免疫力低下的患者中，可能出現PPD 試驗假陰性，從而降低靈敏度[7]；此外，卡介苗的普遍接種會導致假陽性的發生，同時人工記錄結果的方式也會影響判斷的客觀性[8]。

T-SPOT.TB 是近年來運用較為廣泛的檢測結核病的方法，也是一種新興的酶聯免疫斑點試驗，基本原理是將PBMCs 與抗原置于反應孔中進行特異抗體反應，刺激所有的致敏T 細胞；致敏T 細胞分泌的IFN-γ 被預包被在反應孔膜上的特異抗體捕獲，經過洗滌、標記二抗，堿性磷酸酶與細胞因子上不同的抗原決定簇結合；通過洗滌去除無任何標記的抗體；可溶的底物溶液加入每個檢測孔中，在反應部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點，1個斑點代表1個分泌細胞因子的T 細胞，記數斑點數量可以獲得外周血中被結核致敏的T 細胞數量?？ń槊缇旰痛蟛糠址墙Y核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）缺少或丟失與T-SPOT.TB 相同的抗原，因此該試驗不受卡介苗和大部分環境分枝桿菌影響[9-10]，卡介苗導致的假陽性基本可以排除[11]。查閱國內外相關文獻，多篇文獻評估了T-SPOT.TB 在活動性結核病特別是痰涂片陰性結核病中的診斷價值，報道的T-SPOT.TB 總體靈敏度和總體特異度分別為80%和79%，高于PPD 試驗的65%和75%[12-13]。本研究結果顯示，T-SPOT.TB 與其他3種檢測方法相比，靈敏度最高，特異度最低，說明T-SPOT.TB 在診斷結核病方面具有較高的價值。有研究表明，T-SPOT.TB 在潛伏性感染患者中有較高的預測價值，如果為陰性則可以排除活動性結核病[14]。需要注意的是，T-SPOT.TB 測定針對MTB 特異的效應T 淋巴細胞，在感染早期及少數免疫系統功能不全等基礎疾病患者中，如艾滋病感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等都會引起假陰性的發生，從而降低靈敏度[15]。

TB-Ab 檢測采用純化的MTB 特異性外膜抗原，利用斑點免疫金滲濾試驗（dot-immunogold filtration assay，DIGFA）原理，檢測血清中的MTB 抗體，用于結核病的輔助診斷。本研究結果顯示，TB-Ab 檢測的靈敏度為12.24%（較低），特異度為92.19%（較高），說明TB-Ab 檢測可以作為一種初篩試驗，為結核病的診斷提供參考，其陽性結果表明有MTB感染的可能，或近期有結核病患者的密切接觸史。

在結核病高負擔國家中，潛伏性感染者有5%～10%的可能性發展成為活動性結核病，并成為新的傳染源，造成結核病的進一步傳播，WHO 指出，全球僅有37%的結核病患者被確診，發達國家也僅有50%的結核病患者被確診[16]。因此，對潛伏性感染者的有效篩查及結核病的有效防治是控制結核病的根本。T-SPOT.TB 的靈敏度較高，且受機體免疫狀態的影響較小，對結核病的診斷具有較高價值，同時標本獲取方便，只需1管外周血，2 d 快速診斷，但是特異度低，不能作為單獨或決定性的結核病確診依據，需結合患者的年齡、免疫情況、患病狀態等進行綜合評估，同時操作相對復雜，需要較高的實驗技術和實驗條件，價格相對昂貴，在我國基層廣泛開展和推進具有一定的難度。因此，研究新的抗原、開發新的分子診斷標記將是T-SPOT.TB 未來研究的方向[17]。目前，結核病的確診需結合其他檢測方法、臨床表現及影像學檢測，提高靈敏度和特異度，共同作為診斷結核病的依據。

綜 上 所 述， T-SPOT.TB 與PPD 試 驗、TB-Ab 檢 測 和AFS 比較，具有簡便、快速、靈敏度高等優點，是臨床快速診斷結核病的有效檢測方法，但由于特異度較低，需要與其他方法聯合檢測，以提高早期診斷結核病的價值。