外源褪黑素對高粱苗期冷害的緩解作用研究

關鍵詞：高粱；褪黑素；低溫脅迫；生理機制；內源激素

中圖分類號：S514 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0055-09

低溫是限制植物生長的最主要原因之一，對作物生產極具破壞力。作物遭受冷害時光合作用機制損傷嚴重，導致根系生長和養分、水分吸收顯著減少，植株生物膜的膜相和滲透性發生變化，從而造成原生質停滯和細胞內溶液滲漏，擾亂離子平衡，破壞植物酶系統，影響酶活性。植物激素是調控植物生長發育的重要物質，受到低溫脅迫后植物內源激素含量也會有明顯變化，從而影響植株的抗寒能力。

高粱[Sorghum bicolor（L.） Moench]是世界第五大糧食作物，也是我國最早栽培的禾谷類作物之一，具有光能利用效率高、易栽培、適應性強等特點。但是，高粱苗期對低溫敏感，早春寡照低溫多雨天氣（倒春寒）的出現會對幼苗造成低溫損傷，引起植株長勢弱且易感病，進而影響成熟期籽粒產量和質量。

褪黑素（melatonin，MT）是一種生長調節劑，1995年首次在植物中被發現，它的生理作用和生物學效應與天然植物激素類似，有用量小、效率高、低毒性等優勢。大量研究證明，褪黑素除了可以緩解植物在生物脅迫以及非生物脅迫下的不良影響，還影響著植物的多種生理代謝過程，包括種子萌發、細胞氣孔閉合、葉片光合速率等。低溫情況下，植物通常會誘導內源褪黑素的合成以用于抵抗低溫對植物的致命傷害，褪黑素通過增加根和地上部的物質交流來提高植株的抗寒性。由于內源褪黑素合成的局限性，外源褪黑素預處理已逐漸成為提高作物抗逆性的主要手段，施加外源褪黑素可顯著增加冷脅迫下擬南芥的根長、株高和干重。Han等發現，水稻在低溫脅迫下，其光合作用和光系統Ⅱ受到嚴重損傷，外源褪黑素預處理可以通過提高抗氧化酶活性來降低活性氧以及滲透物質的積累量，從而降低細胞損傷程度。外源褪黑素還可以通過調節植物內源激素含量來緩解生物和非生物脅迫的各種不良影響。此外，外源褪黑素還可通過改變生物鐘基因的表達模式和調節冷脅迫下關鍵生理指標的積累模式來緩解對植物營養生長的抑制。但是，褪黑素使用濃度并非越高越好，且已報道的植物使用褪黑素的最適濃度也各有差異：Turk等使用1mmol/L褪黑素處理低溫脅迫下的小麥幼苗效果最佳；Wang等通過基因敲除方式培育出缺乏內源褪黑素的番茄植株并對其進行了低溫脅迫試驗，表明100μmol/L外源褪黑素處理與對照組相比，可顯著緩解低溫損傷：Li等使用200μmol/L褪黑素處理茶樹，表明褪黑素預處理可通過增強其抗氧化能力和氧化還原穩態來減少氧化損傷，從而緩解低溫對茶樹的不良影響。可見，褪黑素濃度會直接影響到作物在各種脅迫下的緩解效果，濃度太低達不到理想效果，濃度過高則會抑制植株生長，所以確定最適的作用濃度是外源褪黑素使用的前提。

目前使用褪黑素緩解高粱苗期干旱、鹽脅迫等方面的研究已有報道，但是外源褪黑素是否能緩解低溫脅迫對高粱幼苗生長的影響尚不清楚。為此，本試驗通過研究外源褪黑素預處理對低溫脅迫下高粱幼苗形態、光合、生理以及內源激素含量的影響，來探明外源褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗的緩解作用機制，以有助于減輕高粱幼苗在早春低溫天氣下受到的不良影響。

1材料與方法

1.1供試材料

供試兩個高粱品種R18（冷敏感材料）和紅纓子（耐冷材料）均由貴州大學酒用原料產業研究院提供。褪黑素（C₁₃H₁₆N₂O₂）購自北京索萊寶科技有限公司，相對分子質量為232.28，分析純。

1.2試驗設計

試驗于2023年7月在貴州大學農學院的人工氣候室和實驗室完成。選取均勻飽滿的高粱種子用10%NaClO溶液浸泡消毒10min，再用蒸餾水多次沖洗后播種至育苗盆（8cm×8cm）。每盆均勻擺放20粒種子，置于培養室中常溫培養（溫度設定為25℃，光／暗周期為16h/8h），待幼苗長至一葉一心期開始葉片預處理，每天早晚（上午9：00;下午18：00）向地上部各噴施一次褪黑素溶液，濃度分別為0、50、100、200、300μmol/L和500μmol/L，分別用CK、MT₅₀、MT₁₀₀、MT₂₀₀、MT₃₀₀、MT₅₀₀表示，連續預處理3d。第4天將低溫組幼苗放人提前預冷的人工氣候箱中。低溫條件：溫度為（4±0.5）℃，相對濕度為75%，光／暗周期為16 h/8 h，光強為15000lx。

確定最適褪黑素濃度后，用供試2個品種設置4個處理進行后續試驗，即常溫對照（CK）、常溫+褪黑素（CK+MT）、低溫對照（LT）、低溫+褪黑素（LT+MT）處理。低溫或常溫處理5d后取樣進行相關指標測定，重復5次。

1.3測定指標及方法

1.3.1生長指標測定 每處理隨機選取高粱幼苗10株，用直尺測量株高。之后，沖洗干凈并擦干幼苗表面水分，使用分析天平稱其鮮重，之后在80℃下烘干至恒重后稱其干重。

1.3.2生理指標測定 參照李賀的方法，采用比色法測定光合色素含量，即在紫外分光光度計（安捷倫Cary3500）470、649、665nm處比色讀數。葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量計算公式如下：

葉綠素a（Chl a）=13.95（OD₆₆₅）-6.88（OD₆₄₉）；

葉綠素b（Chl b）=24.96（OD₆₄₉）-7.32（OD₆₆₅）；

類胡蘿卜素含量（Car）=[1000（OD₄₇₀）-2.05 Chl a-111.48 Chl b]/245。

1.3.3內源激素含量測定 委托江蘇三黍生物科技有限公司運用超高效液相色譜一電噴霧串聯四極桿質譜儀（UPLC-ESI-MS/MS）內標法對生長素、脫落酸、赤霉素等多種植物內源激素進行定量分析，每處理重復3次。

1.4數據處理與分析

利用SPSS 22軟件對數據進行統計學分析，采用單因素方差分析（ANOVA）法對數據進行方差分析和多重比較（α=0.05），使用Origin 2022軟件制圖。圖表中的數據為平均值±標準差。

2結果與分析

2.1不同濃度褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗形態指標的影響

如圖1所示，低溫脅迫下兩個高粱品種的株高、地上部干重均隨著褪黑素濃度升高呈現先上升后下降的變化趨勢。與常溫對照（CK）相比，低溫脅迫對高粱幼苗有極大的負面影響，低溫處理下R18和紅纓子的株高僅有CK的44.4%和49.0%，地上部干重只有CK的40.9%和43.2%。與低溫對照（LT）相比，噴施不同濃度的褪黑素對低溫脅迫下的高粱幼苗都具有一定的緩解作用，褪黑素濃度為200μmol/L時緩解效果最好，即R18和紅纓子的株高分別增加33.5%和32.0%，地上部干重分別增加45.6%和31.5%，且其對冷敏感材料R18的緩解效果更加明顯。

2.2不同濃度褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗生理指標的影響

為進一步確定后續試驗的褪黑素濃度，對不同濃度褪黑素處理下的高粱幼苗相關酶活性以及MDA含量進行測定，結果如圖2所示。低溫脅迫下，兩個高粱品種的SOD、CAT、POD活性均隨褪黑素處理濃度的增加呈先上升后下降趨勢，均在褪黑素濃度為200μmol/L時達到最大值，說明200μmol/L濃度下高粱幼苗會產生大量的抗氧化酶以抵抗低溫損傷。低溫脅迫下，植物細胞往往會發生膜脂過氧化，造成MDA大量積累，最終造成細胞凋亡。低溫脅迫下，R18和紅纓子的MDA含量達到常溫對照的3.5倍和2.3倍，說明冷敏感品種往往比耐冷品種受到的低溫損傷更嚴重。外源褪黑素預處理會有效減緩MDA的積累速度，并隨褪黑素處理濃度升高，其MDA含量呈先下降后上升趨勢，均在200μmol/L濃度時降到最小值。以上結果證明200μmol/L褪黑素預處理是緩解高粱幼苗低溫脅迫的最適濃度，故以此作為后續試驗的褪黑素濃度。

2.3外源褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗形態指標的影響

由圖3和表1可知，外源褪黑素預處理對常溫和低溫脅迫下高粱幼苗都有一定的促進作用，但低溫下的效果更明顯。與CK相比，CK+MT處理對株高、根長（R18除外）和地上部地下部干重（R18除外）都有所促進，但均未達到顯著差異，低溫脅迫（LT）導致株高、根長和地上部地下部干重都顯著降低：與LT相比，LT+MT處理高粱株高、根長和地上部地下部干重都顯著增加。這說明褪黑素處理對兩個高粱品種的低溫損傷都有明顯的緩解作用。

2.4外源褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗光合色素含量的影響

如圖4所示，R18和紅纓子兩個品種在低溫脅迫下，其葉綠素a、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量較CK均顯著降低，褪黑素預處理下兩個品種幼苗色素含量較LT處理都顯著增加（紅纓子類胡蘿卜素含量除外）。尤其是葉綠素a含量變化最明顯，與CK相比，LT處理R18和紅纓子的葉綠素a含量分別下降21.8%和33.6%，噴施褪黑素處理葉綠素a含量分別回升23.7%和24.5%。常溫下，褪黑素處理對兩個品種的光合色素含量無顯著影響。

2.5外源褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗相關生理指標的影響

與CK相比，LT處理R18的游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量分別增加2.8倍、1.8倍和30%，紅纓子分別增加1.8倍、1.9倍和50%。施加外源褪黑素幼苗游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量繼續增加，與LT相比，R18的三者含量分別增加11.8%、8.9%和11.2%，紅纓子的分別增加16.4%、42.7%和16.5%。說明外源褪黑素預處理可以誘導低溫下高粱幼苗積累大量滲透調節物質，繼而維持細胞內部環境穩態。

抗壞血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環可以維持蛋白質的穩定性，對生物膜系統結構的完整性及防御膜膜脂過氧化起重要作用。其中，谷胱甘肽是一種重要的非酶抗氧化劑，其含量多少可以有效地反映植株的抗寒能力。如圖5所示，褪黑素預處理誘導低溫脅迫下ASA-GSH循環相關物質的積累，與LT相比，褪黑素預處理幼苗的AsA、GSH含量顯著增加，R18分別增加3.9%和8.9%，紅纓子分別增加12.1%和10.5%；GR活性也顯著上升，R18和紅纓子分別上升28.3%和68.1%。

2.6外源褪黑素對低溫脅迫下高粱幼苗內源激素含量的影響

植物內源激素是重要的生長調節因子，并在誘導植物抗寒性方面起著重要作用。當植物受到低溫脅迫時，內源激素便誘導耐寒基因的表達，從而提高植物的抗寒性，此過程中通常生長素與脫落酸協同起作用，調控植物的生長發育。Zhang等研究表明，低溫脅迫下小麥中的脫落酸含量增加，生長素和赤霉素含量下降，啟動下游脫落酸反應中低溫相關基因的表達，從而增強小麥的抗寒性，而本研究中低溫脅迫下高粱幼苗內源激素含量的變化趨勢與其有相同點也有不同點。本研究中，低溫脅迫下褪黑素處理高粱幼苗生長素和吲哚類物質含量顯著升高，脫落酸含量顯著下降，并通過其他植物激素協同調控低溫下的生長發育過程，這與前人的研究結果一致。本研究中赤霉素A₁、赤霉素A₃、赤霉素A₇含量的變化趨勢結果不一致的原因也有待進一步探討。

綜上所述，200μmol/L褪黑素外源施加可以作為緩解低溫脅迫對高粱幼苗不利影響的有效方法。此措施通過促進高粱幼苗光合色素的合成、提高抗氧化酶活性、加強細胞膜的穩定性、增加滲透調節物質含量、提高AsA-GSH循環效率以及調控多種內源激素含量來增強高粱幼苗的抗寒能力，緩解低溫脅迫下的幼苗損傷。