黃瓜根腐病生防芽孢桿菌的篩選、鑒定及協同效應

關鍵詞：黃瓜根腐病；鐮刀屬；芽孢桿菌；協同效應；鑒定

中圖分類號：S436.3：S642.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0134-07

隨著我國農業設施栽培規模的不斷擴大，蔬菜連作障礙問題也日益嚴重，其中由病原菌引發的土傳病害是主導因素之一。近20年里，天津市以根腐病、根結線蟲病、枯萎病和青枯病等為代表的蔬菜土傳病害危害日趨嚴重，其中黃瓜根腐病是天津地區黃瓜生產上危害極其嚴重的一種土傳病害，導致該病害的病原菌復雜多樣。據報道，天津市該病害的病原菌主要為甜瓜疫霉（Phytophthora melonis）以及尖孢鐮刀菌（Fuusar-ium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、腹狀鐮刀菌（F.ventricosu）等多種鐮刀屬真菌。長期以來，該病害的防治主要依賴于化學藥劑進行土壤消毒，雖然可在一定程度上減輕病害的發生，但同時也引發病原物抗性增加、土壤微生物種群多樣性減弱、土壤農藥殘留積累等問題。生物防治具有生防菌源廣泛、作物不易產生抗藥性、更易維持土壤微生態平衡等優點，已成為土傳病害防治的主導方向之一。

芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌因種類繁多、抗逆性強、繁殖快、代謝產物豐富、生防機理寬泛等特點而成為眾多生防菌中的優勢種類，并成為進一步研發生防菌劑的理想菌株。近年來，利用芽孢桿菌防治黃瓜根腐病的相關研究越來越多。楊東亞等篩選出多株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis），其對由腐皮鐮刀菌引起的黃瓜根腐病的防效達65%以上，并促進黃瓜幼苗的生長；賀字典等利用太陽能消毒與3株植物根際促生菌（PGRP）聯合防治由F.solani f.sp.cucurbitae引起的黃瓜根腐病，其中一株甲基營養型芽胞桿菌（B.methyl-otrophicus）通過300倍蘸根處理防效最高可達89.49%。Qi等發現魚蛋白水解物（FPHs）與解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌聯用具有抑制黃瓜根腐病（F.solani）的效果，且具有促進黃瓜幼苗生長和提高基質養分含量的潛力。Punja等預防性施用枯草芽孢桿菌菌劑（Rhapsody）可有效減少由F.oxysporum引起的黃瓜根腐病的發生，并促進植株的生長。黃瓜根腐病是由多種病原菌復合侵染導致的，單一的生防菌株往往很難全面有效地防治該病害，因此多菌株的聯合防治逐漸成為植物病害防治的主要手段，在動物病害防治中也被廣泛應用。

本研究以引起黃瓜根腐病的尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌為靶標，從天津市4個區的健康黃瓜根際土壤分離篩選對病原菌有抑制作用的芽孢桿菌，并進行多株生防菌株的相容性以及協同應用的研究，明確主要生防菌株的分類地位，以期為天津市黃瓜根腐病的防治提供生防菌資源，為黃瓜根腐病的田間防治和菌劑研發提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌均由天津市農業科學院植物保護研究所提供。

土壤樣品：篩選生防菌的土壤采集自天津北辰區、靜海區、武清區和西青區黃瓜種植地，每個區選4個不同的地塊采集，每個地塊從東南西北中5個位點取樣，將健康黃瓜植株從土壤中完整取出，抖掉大塊土，用毛刷輕輕刷取黃瓜根際土壤，每個地塊為一個樣本，將土壤裝入無菌樣品袋，帶回實驗室，于4℃冰箱保存備用。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、LB固體及液體培養基。

供試黃瓜品種為津春4號。

1.2菌株分離純化

將每個土壤樣品經常溫風干、粉碎、過100目篩后充分混勻。稱取8g土壤裝入含12mL無菌水的50mL無菌離心管中，置于30℃、140r/min的搖床振蕩30min制成含菌混合液，利用梯度稀釋法將混合菌液稀釋10⁴、10⁵、10⁶倍。分別吸取各濃度菌液100μL，加入到LB平板中，涂布器涂勻，放入30℃恒溫培養箱中倒置培養3d，每個濃度涂布5個平板。待菌株長出后，挑選形態不同的單菌落進行轉接純化，并于4℃保存備用。

1.3生防菌株的篩選

采用平板對峙法進行生防菌株初篩。以上述兩種病菌為指示菌，初步篩選對其有拮抗能力的生防菌株。在PDA培養基中心接種直徑5mm的病原菌菌餅，采用接種針點接法，將生防菌點接在以病原菌餅為中心并在距菌餅四周3.5cm、以正方形分布的4個頂點位置，每個點接種不同菌株，以不接生防菌的平板為對照，重復3次。平板置于30℃黑暗培養7d，觀察是否有拮抗帶的產生。

選擇產生拮抗圈的菌株進行復篩試驗。采用初篩的方法，將一株生防菌點接在距病原菌3.0cm的4個點，培養7d左右，即病原菌剛長滿培養基時，測量抑菌圈直徑并計算抑制率。抑制率（%）=（對照組菌落直徑一處理組菌落直徑）／對照組菌落直徑×100。每處理重復3次。

1.4生防菌株間相容性測定

選擇對兩種病原菌抑制率均高于40%的生防菌株，采用濾紙片法進行生防菌株間相容性測定。將生防菌菌株接種于LB液體培養基中，置于30℃、140r/min的搖床振蕩24h，用無菌水將培養菌液調至OD₆₀₀=1.0，之后取100μL涂布于LB培養基上，待干燥后，在平板上放置直徑為5mm的無菌濾紙片，滴加3μL其他生防菌菌液，于30℃恒溫培養，重復3次。2d后觀察有無抑菌圈產生，以確定不同待測生防菌菌株間的相容性。

1.5生防菌協同應用潛力評價

1.5.1生防菌株無菌濾液對病原菌的抑制作用測定取相容性較好的生防菌株，采用1.4中的方法活化調整各菌液OD₆₀₀=1.0，制成單株生防菌種子菌液。取單株生防菌種子菌液各2mL混勻復配為復合生防菌種子菌液。參考魏靖宇等的方法將單株和復合生防菌種子菌液分別接種到LB液體培養基中，30℃、140r/min的搖床振蕩培養24h后，10000r/min離心20min。離心后吸取上清液，用0.22μm一次性微孔膜過濾，制成無菌濾液后放入4℃冰箱保存備用。將無菌濾液按照15%的比例加入到融化的PDA培養基中（45～50℃）。將病原菌接種至PDA培養基中央，重復3次，以加入無菌水的PDA培養基為對照，30℃培養箱中培養7d左右，即對照組病原菌剛要長滿平皿時，計算抑制率。

1.5.2盆栽試驗 按照1.5.1中的方法將生防菌液離心后去上清，用無菌水將單株和復合菌重懸稀釋為1×10⁶cfu/mL的菌懸液備用。設置單株菌懸液處理組（BL-01、BL-09、BL-21）、復合菌懸液處理組（BL-01+BL-09+BL-21）以及清水對照組。將長勢一致的一葉一心黃瓜苗移栽到含20g健康土壤的營養缽中。單株菌懸液處理組和復合菌懸液處理組每盆澆15 mL菌液，對照組澆15mL清水。7d后，將孢子濃度為10⁶cfu/mL的兩種病原菌菌懸液按體積比1：1混勻，分別對5個處理組灌根接種10mL。每處理10盆，設置5次重復。30d后，將所有黃瓜的根系完整挖出，觀測黃瓜根系變色程度。黃瓜根腐病分級標準參考文獻，計算病情指數。病情指數=∑（各級病株數×代表級值）／（調查總株數×最高病級代表值）；防效（%）=（對照組病情指數-處理組病情指數）／對照組病情指數×100。

1.6生防菌株的鑒定

1.6.1形態特征觀察及生理生化測定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》對細菌在培養基上的菌落顏色、形態、粘稠性等性狀進行描述，并進行革蘭氏染色、好氧性、淀粉水解和V-P等生理生化特性分析。

1.6.2分子生物學鑒定 利用擎科生物柱式細菌基因DNA抽提試劑盒提取菌株DNA，利用16SrDNA、gyrA、rpoB區段序列引物對目標菌株的基因組進行PCR擴增（表1）。PCR產物委托擎科生物技術有限公司進行測序。根據基因測序結果，在NCBI官方網頁上通過Nucleotide Blast程序從GenBank數據庫中調出同源性高的菌株的基因序列，利用MEGA X軟件進行序列多重比對后，采用NJ法構建系統發育進化樹，來確定目標菌株的分類地位。

1.7數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2020和SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統計分析，應用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗，Plt;0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1土壤中生防菌的分離、篩選及抑菌效果

從天津4個區的黃瓜種植土壤中共分離出1327株細菌，其中對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌有抑制作用的菌株分別有72株和64株，分別占5.4%和4.8%。有8株細菌對兩種病原菌的抑制率均達40%以上（表2），分別為BL-01、BL-09、BL-14、BL-20、BL-21、BL-29、BL-33、BL-40，其中BL-29和BL-40的抑制效果最好，對兩種病菌的抑制率均超過50%。

2.2生防菌間的相容性

8株生防菌株間的相容性結果如表3所示。其中，菌株BL-29與所有菌株均存在雙向拮抗作用，可產生明顯的拮抗菌圈（圖1A）；菌株BL-40除了與BL-20有單方拮抗外，與其他菌株均表現為雙向拮抗；菌株BL-01、BL-09和BL-21彼此間互不拮抗、互相相容（圖1B—1D），可以避免復合菌之間相互競爭、相互抑制，進而影響自身的拮抗能力，所以選擇菌株BL-01、BL-09和BL-21進行后續試驗。

2.3生防菌協同應用潛力評價

2.3.1生防菌株無菌濾液對黃瓜根腐病病原菌的抑制作用 菌株BL-01、BL-09和BL-21單株菌和復合菌無菌濾液對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的抑制作用如表4，可以看出，復合菌無菌濾液對兩致病菌的抑制率顯著高于單株菌，其中對尖孢鐮刀菌抑制率平均高出15.9%，對腐皮鐮刀菌抑制率平均高出16.4%。

2.3.2生防菌懸液對黃瓜根腐病的盆栽防治效果 如表5所示，各生防菌懸液處理組的病情指數均顯著低于CK，即生防菌懸液均能顯著降低黃瓜根腐病的發生。菌株BL-01、BL-09、BL-21的菌懸液對黃瓜根腐病的防效分別為46.5%、48.3%、42.1%，而三者的復合菌懸液對黃瓜根腐病的防效達67.6%，顯著高于各自單株菌懸液，平均高出22個百分點。

2.4生防菌株鑒定

2.4.1形態學特征 在LB培養基上，菌株BL-01的菌落呈近圓形、白色、不透明，邊緣光滑、中間多條狀凸起；菌株BL-09的菌落近圓形、乳白色、不透明，邊緣不規則、中間山棱狀凸起；菌株BL-21的菌落近圓形、白色、半透明，邊緣不規則、濕潤、無光澤。3株菌在顯微鏡下均呈桿狀。

2.4.2生理生化特性 如表6所示，3株菌的生理生化特性極其相似，除甲基紅反應（M-R）試驗中BL-01和BL-09為陰性、BL-21為陽性外，其余的檢測特性均一致，即革蘭氏染色呈陽性，V-P試驗呈陽性，可產生淀粉酶，明膠液化呈陰性，硝酸鹽還原為陽性。

2.4.3分子鑒定 利用16S rDNA、gyrA和rpoB多基因構建系統發育樹，結果（圖2）表明，菌株BL-01、BL-09與菌株Bacillus velezensis WLYS23聚為一支，支持率達100%，結合形態學和生理生化結果，將菌株BL-09、BL-01鑒定為貝萊斯芽孢桿菌：菌株BL-21與菌株Bacillus halotolerans（MEC_B334和MBH1）聚為一支，支持率達99%，結合形態學和生理生化結果，將菌株BL-21鑒定為耐鹽芽孢桿菌。

3討論與結論

在眾多植物病害生防細菌中，芽孢桿菌是存在最廣泛且極易從土壤、空氣以及植株中分離得到的，也是許多植物根際促生菌（PGPR）的重要組分，不僅對多種植物病害具有較好防治作用，而且在促進植物生長、活化養分、改善微生物區系等方面發揮重要作用。尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌是引起天津市黃瓜根腐病的主要病原菌，針對這兩種病原菌，本研究從天津4個區的健康黃瓜種植土壤中共分離出1327株細菌，其中對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌有抑制作用的菌株分別有72株和64株，所占比例分別為5.4%和4.8%：有8株細菌對兩種病原菌的抑制作用達40%以上，其中菌株BL-29和BL-40的抑制效果最好，均超過50%。

由于黃瓜根腐病由多種病原物復合侵染產生，單一的生防菌株不易兼顧對多種病原菌的抑制作用。本研究對8株生防細菌間相容性測試發現，菌株BL-01、BL-09和BL-21彼此間互不拮抗，具有更好的相容性，三者所形成的無菌濾液對兩種病原菌的抑制作用也顯著高于各自單株菌的無菌濾液。在盆栽試驗中，菌株BL-01、BL-09和BL-21所組成的復合菌懸液對黃瓜根腐病的防效顯著好于各自單株菌懸液。這可能是復合菌株在生長過程中，因菌株間的生理特性差異，相互間增加了代謝的協同作用以及為對方提供所需營養物質，增加了更多菌落數量，或產生了單菌落生長所不能形成的產物。芽孢桿菌與真菌的混合發酵液可上調芽孢桿菌的碳氮代謝、氧化還原活性、產孢、環境信息響應和趨化性以及次級代謝產物的生物合成相關基因的表達，從而提高營養物質的代謝和競爭力、生存能力、定植能力，進而提高對病害的生防效果。因此，目前生防菌劑和菌肥的合成和應用也大多使用復合菌株。

由于芽孢桿菌屬的種類繁多，形態差異小，16SrDNA序列又具有高度的相似性，因此常常與一些特異性基因結合對芽孢桿菌進行鑒定。目前可用于檢測和鑒定芽孢桿菌的特異性基因很多，如rpoB、gyrA和cheA等，另外通過基因組比較的方式也可獲得大量特異性基因。本研究中利用特異性基因gyrA和rpoB進行多基因建樹，明確了3株細菌的分類地位，即菌株BL-09和BL-21鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，菌株BL-21為耐鹽芽孢桿菌。

綜上所述，本試驗篩選出拮抗黃瓜根腐病的3株相容生防菌，通過向培養基摻無菌濾液和盆栽體外試驗，明晰了3株芽胞桿菌單一和協同處理對黃瓜根腐病的生防效果，為黃瓜其他真菌病害生防菌資源的探索提供了思路。鑒定的貝萊斯芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌可作為黃瓜鐮刀菌根腐病生防及黃瓜土壤連作障礙保育菌劑開發的備用菌，可為黃瓜病害防控研究提供參考。