裸藻β-1，3-葡聚糖提高斑馬魚及細胞免疫活性研究

關鍵詞：纖細裸藻；β-1，3-葡聚糖；斑馬魚；免疫活性

中圖分類號：TS201.4：Q952 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0158-07

近年來，通過營養干預來改善身體機能的方法愈發受到人們重視，在此背景下，免疫系統調節類食品的開發與研究具有廣闊的應用前景。β-葡聚糖是一類以D-吡喃型葡萄糖為基本單元，由β-糖苷鍵連接而成的非淀粉多糖，具有廣泛的生物活性。目前，多種來源的β-葡聚糖作為食品原料或食品添加劑已在中國、美國、澳大利亞、日本等多個國家被批準使用。作為一種天然的免疫調節劑，裸藻β-1，3-葡聚糖被認為可以促進免疫系統的活性，增強機體的免疫力，并有助于抑制炎癥反應，從而對身體健康產生積極影響。

β-葡聚糖廣泛存在于谷物、細菌、真菌和藻類中。在谷物中，β-葡聚糖主要存在于胚乳和糊粉層細胞壁中，其中以燕麥和大麥中含量最高，約為1.8%～7.0%。在微生物中，β-葡聚糖主要存在于細胞壁中，其中在酵母細胞壁成分中的占比高達50%～65%。又因為酵母價格低廉，使其成為β-葡聚糖的主要來源。然而，β-葡聚糖具有特殊的三維螺旋結構，常見的純化方法難以除盡細胞壁中的其他物質，如結構性蛋白、脂質等，致使其在工業化生產中具有一定的局限性。許多微藻（如裸藻門、硅藻門、金藻門）可以產生不同結構和溶解性的β-葡聚糖，這些微藻源的β-葡聚糖已經成為非常有潛力的生物資源。其中，裸藻沒有細胞壁，對營養成分的吸收率高達93%，富含大量的蛋白質、多糖、維生素和多不飽和脂肪酸，是一種富含天然β-葡聚糖的新超級食物來源，為我國2013年獲批的8種新食品原料之一。裸藻細胞質內含有一種具有沒有分支的線性β-（1，3）主鏈的β-1，3-葡聚糖（又稱裸藻副淀粉），是裸藻用來儲存碳當量的主要物質。與其他p -葡聚糖相比，裸藻β-1，3-葡聚糖產率極高，通常占細胞干重的90%以上，并且更容易純化。可以根據裸藻β-1，3-葡聚糖不溶于水的特點，將粉碎過的藻細胞離心，用低質量分數的SDS溶液連續沖洗去掉蛋白即可實現純化，其提純方法兼具低成本與高產率的優勢。

斑馬魚模型已被廣泛用于研究作為抗炎、免疫調節劑和抗氧化劑調節劑的化合物的體內生物活性。在斑馬魚胚胎形成的第1天，先天性免疫系統即可被激活，需要1～4天發育成熟，適應性免疫系統則需要4～6周才會在形態和功能上發育完善，與其他模型動物相比，利用斑馬魚模型評估化合物的免疫功效耗時更短。而且，斑馬魚模型維護成本低、需要的目標化合物數量少，更適合高通量篩選。斑馬魚已成功用于評估酵母β-1，3-葡聚糖的生物活性，Rodriguez等在研究腹腔注射β-葡聚糖對實驗感染嗜水氣單胞菌斑馬魚的影響時發現，當濃度為5mg/mL時可明顯降低因感染嗜水氣單胞菌而導致的死亡率。細胞快速評價方法是藥物篩選、毒性評價和生物學研究中常用的重要手段，趙文婷等利用細胞快速評價方法發現，當酵母β-1，3-葡聚糖濃度為500μL/mL時，能顯著促進斑馬魚噬細胞的吞噬功能，作用增強了48%。

本研究旨在通過斑馬魚模型和細胞模型快速評價方法，系統評估裸藻樣品A（纖細裸藻β-1，3-葡聚糖）、樣品B（纖細裸藻粉）和樣品C（商業纖細裸藻粉）的免疫功效。以深入了解纖細裸藻β-1，3-葡聚糖對免疫系統的潛在調節作用，為其在食品、藥物等領域的開發應用提供科學依據。同時，比較不同裸藻粉樣品的效果，有助于篩選出具有較高免疫增強活性的樣品，可為相關領域的產品開發和保健品推廣提供有力支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

纖細裸藻粉（Euglena gracilis）（樣品B）由山東納美達生物科技有限公司提供；裸藻β-1，3-葡聚糖（樣品A）由纖細裸藻粉在強堿（pHgt;12）條件下提純獲得；商業纖細裸藻粉（樣品C）購自建明（中國）科技有限公司。野生型斑馬魚AB品系、轉基因斑馬魚品系均由山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供。

1.2纖細裸藻β-1，3-葡聚糖的分離提取

采用SDS提取法提取β-1，3-葡聚糖，取50 mL離心管，分別加入2g左右纖細裸藻粉和30 mL蒸餾水，在渦旋振蕩器上充分振蕩后，3000r/min離心10min，棄上清液，重復以上步驟3～4次；向沉淀中加入30 mL SDS，在超聲破碎儀（SCIENTZ-ⅡD寧波新芝生物科技股份有限公司）以200 kHz、6號振幅桿、超聲頻率為40%～45%超聲18min，3 000 r/min離心10min，棄上清液；將沉淀于60℃烘干24 h后得到的β-1，3-葡聚糖。

1.3樣品檢測指標及方法

1.3.1安全性劑量檢測 選用發育至24 hpf（受精后24h）的健康野生型斑馬魚AB品系，轉移至12孔板，每孔15條。對照組給予斑馬魚養殖水，試驗組給予不同濃度（0、50、100、200、400、800μg/mL）的樣品溶液，置于28.5℃的恒溫培養箱中培養至72hpf。然后在SZX16型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察，并統計斑馬魚死亡率，每處理重復3次。

1.3.2免疫促進試驗 選用發育至24hpf的健康轉基因斑馬魚品系，對照組（CK）給予斑馬魚養殖水，模型組（Model）給予100μg/mL的長春瑞濱溶液，試驗組給予不同濃度（25、50、100μg/mL）的樣品溶液，脫膜后轉移至12孔板，每孔15條。置于28.5℃的恒溫培養箱中培養至48hpf。熒光顯微鏡下觀察，采用DP2-BSW圖像采集系統（日本Olympus公司）拍照，統計斑馬魚尾部熒光細胞數目，每處理重復3次。

1.3.3細胞增殖試驗 將小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（Raw 264.7細胞）培養于含10%胎牛血清（FBS）和雙抗的DMEM培養基（完全培養基）中，置于37℃和5% CO₂的細胞培養箱中培養，每2～3d傳代一次。傳代時，無菌條件下在操作臺上將培養瓶中Raw 264.7細胞除去細胞培養基，加入3mL新鮮的DMEM培養基后，吹打混勻，將細胞接種于96孔板，細胞濃度為1×10⁴個/mL，置于細胞培養箱中培養24 h。24 h后加入不同濃度（0、50、100、200、400μg/mL）的樣品溶液處理細胞，每組4個復孔，繼續培養24 h；然后每孔加入10μL CCK8試劑，培養2h后，在酶標儀上檢測450 nm波長下各孔的光密度（optical density，OD），計算細胞存活率。存活率（%）=OD_試驗／OD_對照×100。

1.3.4抗炎試驗 將Raw 264.7細胞以每孔1×104的細胞濃度接種于96孔板中，培養條件同1.3.3。培養24h后進行藥物處理，模型組更換含1μg/mL LPS（脂多糖，Lipopolysaccharides）的培養基，藥物組更換含不同濃度（25、50、100μg/mL）樣品的培養基，陽性對照組（Positive）更換含50μmol/L吲哚美辛（購自北京索萊寶科技有限公司）的培養基。每組4個復孔。在37℃細胞培養箱中處理24h后，取50μL細胞培養液于96孔細胞培養板中，先后加入50μL Griess Reagent Ⅰ和50μL Griess ReagentⅡ試劑混勻。使用酶標儀在540 nm波長處測量OD值。通過Griess反應測定培養液中一氧化氮（NO）含量。NO含量（%）=（OD_試驗-OD_對照）／（OD_模型-OD_對照）×100。

1.4數據處理與分析

使用ImageJ軟件統計斑馬魚尾部熒光細胞數目。所有數據顯示為“平均值±標準差”。使用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和獨立樣本t檢驗（t-test）分析，顯著性水平均設為Plt;0.05。使用Origin 2022軟件對數據進行可視化展示。

2結果與分析

2.1 β-1，3-葡聚糖安全劑量確定

如圖1所示，不同濃度樣品作用于發育至24hpf的斑馬魚幼魚48h后，對于樣品A，當濃度≤400μg/mL時，斑馬魚存活率均在90%以上，當濃度為800μg/mL時，斑馬魚存活率顯著下降，為75%左右；對于樣品B，當濃度≤200μg/mL時，在處理后的48h內各組斑馬魚發育正常，而濃度在400μg/mL和800μg/mL時，斑馬魚存活率顯著降至30%以下；對于樣品C，在濃度為400μg/mL和800μg/mL時斑馬魚存活率顯著下降。結果表明，樣品A對斑馬魚的安全劑量為≤400μg/mL，樣品B和樣品C對斑馬魚的安全劑量均為≤200μg/mL。

2.2不同樣品對斑馬魚免疫性能的影響

不同樣品作用于斑馬魚幼魚48 h后，在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照，結果（圖2）表明，與CK相比，Model組斑馬魚尾部免疫細胞數目明顯減少，說明免疫抑制模型構建成功；與Model組相比，樣品A、B、C均可以使斑馬魚尾部的免疫細胞數目增加。

通過對免疫細胞數目統計分析（圖3）發現，與Model組相比，當樣品A濃度為50μg/mL和100μg/mL，樣品B和C濃度為100μg/mL時，斑馬魚尾部免疫細胞顯著增加，各樣品其他濃度與Model組相比免疫細胞數目雖有增加但差異并不顯著。

2.3不同樣品對Raw 264.7細胞增殖的影響

不同劑量的樣品處理Raw 264.7細胞24 h后，通過CCK8試劑檢測細胞活力。結果（圖4）表明：與CK相比，各樣品在≤200μg/mL濃度下對細胞的活性均無顯著影響：當樣品濃度達到400μg/mL時，細胞活力顯著下降。確定樣品A、B和C的安全濃度均為≤200μg/mL。

2.4不同樣品對Raw 264.7細胞抗炎性的影響

通過用1μg/mL的LPS處理Raw 264.7細胞建立細胞炎癥模型（Model），50μmol/L吲哚美辛作為陽性對照（Positive），用不同樣品處理細胞。結果（圖5）表明：陽性對照組NO含量顯著下降，驗證了實驗模型的有效性；樣品A在50μg/mL和100μg/mL時，培養液中NO含量明顯下降，而在25μg/mL時沒有明顯變化，表明樣品A可能在一定濃度范圍內對抑制炎癥反應具有明顯效果；樣品B和樣品C在100μg/mL劑量下，培養液中NO含量顯著下降，表明兩個樣品在高濃度下可能有一定的抗炎作用，而在較低濃度下效果較弱或不明顯。

3討論與結論

3-1，3-葡聚糖是裸藻的主要活性成分，已有研究表明，β-1，3-葡聚糖具有多種功能，包括調節免疫反應和降低感染發生率的作用。本研究中，檢測了樣品A（纖細裸藻β-1，3-葡聚糖）、樣品B（纖細裸藻粉）、樣品C（商用纖細裸藻粉）在安全劑量下的免疫促進作用，并通過不同的模型，比較了纖細裸藻β-1，3-葡聚糖對細胞增殖和抗炎性的影響。

在評估免疫調節劑的功效時，認識到其作用的雙重性質至關重要。纖細裸藻β-1，3-葡聚糖發揮最佳的免疫調節作用是通過適宜的劑量實現的，劑量過高可能導致免疫抑制或細胞凋亡。已有研究報道，從釀酒酵母中純化的β-1，3-葡聚糖濃度與龍蝦粒細胞活力之間存在負相關性，劑量閾值為0.005%；β-1，3-葡聚糖對鯉魚前腎白細胞具有明顯的促凋亡作用，劑量閾值為500mg/mL或更高。本研究中，纖細裸藻β-1，3-葡聚糖對斑馬魚的安全閾值為400μg/mL，這種安全性的差異可能對葡聚糖在不同領域的應用產生重要影響。此外，本研究還發現，與纖細裸藻粉相比，纖細裸藻β-1，3-葡聚糖具有更高的安全性。說明在實際應用中，選擇纖細裸藻β-1，3-葡聚糖可能更為可靠，因為它在維持所需效果的同時，能更大程度上避免對生物體的潛在危害。

β-葡聚糖被認為可以激活各種免疫細胞，包括巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、樹突細胞等，具有免疫調節和免疫促進的潛力，對免疫系統有刺激作用。Sonck等發現裸藻β-1，3-葡聚糖對豬嗜中性粒細胞和單核細胞中活性氧（ROS）的產生有顯著的活化作用。Russo等研究表明，β-葡聚糖可以作為一種安全有效的天然免疫系統輔助因子，其經過聲波化和堿化處理后可使人體炎性因子（NO、TNF-α、IL-6和COX -2）上調。本研究從纖細裸藻提取并制備了經堿化處理的裸藻β-1，3-葡聚糖，發現當其濃度為50μg/mL和100μg/mL時，斑馬魚尾部免疫細胞數量顯著增加。這表明β-1，3-葡聚糖在這兩種濃度下可能對免疫系統產生明顯的刺激作用，具有生物激活免疫反應的能力。巨噬細胞通過釋放多種因素，例如促炎癥細胞因子、氮氧化物和活性氧簇等，在特異性和非特異性免疫反應中發揮關鍵作用。其中，NO為一種無機自由基氣態分子，具有廣泛的生理功能，參與機體內各種生化調節，可能與多種疾病的發生和發展密切相關。NO作為關鍵的第二信使，在病原體感染過程中對免疫反應有顯著影響，本研究結果表明，纖細裸藻β-1，3-葡聚糖以濃度依賴的方式顯著誘導Raw 264.7巨噬細胞產生NO。

β-葡聚糖的理化性質和生物活性可能受到其結構變異性的顯著影響，這取決于其來源。Long等發現通過γ射線輻照制備的水溶性、低分子量（約25kDa）β-葡聚糖能有效降低小鼠血脂和血糖水平。Chen等發現在高原裸大麥中提取的β-葡聚糖對實驗嚙齒動物的胃腸道具有保護作用，能減輕乙醇誘導的胃黏膜損傷并促進腸道健康。Aoe等研究發現，大麥β-葡聚糖的攝入會減少內臟的脂肪。以上研究表明，不同來源的β-葡聚糖可能存在著生物學上的差異，對其進行細致研究至關重要。

綜上，樣品A（纖細裸藻β-1，3-葡聚糖）對斑馬魚幼魚的安全劑量為≤400μg/mL，樣品B（纖細裸藻粉）和樣品C（商用纖細裸藻粉）對斑馬魚幼魚的安全劑量均為≤200μg/mL；50μg/mL和100μg/mL裸藻β-1，3-葡聚糖對斑馬魚免疫細胞數量具有明顯的促進作用；100μg/mL樣品B、C對斑馬魚免疫細胞數量具有明顯的促進作用。樣品A、B、C對Raw 264.7細胞的安全劑量均為≤200μg/mL。樣品A在50μg/mL和100μg/mL劑量下，樣品B、C在100μg/mL劑量下，Raw 264.7細胞培養液中NO含量均明顯降低，說明樣品具有免疫調節（抗炎）作用。以上結果表明樣品A、B、C對斑馬魚和Raw 264.7細胞均具有免疫促進作用，其中樣品A的免疫促進作用優于樣品B和樣品C。