具核梭桿菌經鐵死亡途徑破壞體外腸道上皮屏障模型的研究

[摘要] 目的 探究具核梭桿菌（F. nucleatum） 感染對體外腸道上皮屏障的影響及可能的機制。方法 人結直腸腺癌細胞Caco-2 細胞接種于Transwell 小室構建體外腸道上皮屏障模型。采用葡聚糖硫酸鈉（DSS） 和F. nucleatum建立細胞損傷和感染模型，實驗分為CON組、FN組、8%DSS 組和FN+8%DSS 組，檢測F. nucleatum對有無DSS 處理的上皮屏障的影響并評估鐵死亡在其中的作用；隨后引入鐵死亡抑制劑鐵抑素1 （Fer-1） 和去鐵胺（DFO），探究抑制鐵死亡對受損上皮屏障的作用。實驗中，采用細胞計數試劑盒8 （CCK-8） 檢測細胞增殖；乳酸脫氫酶（LDH） 法檢測細胞損傷；跨上皮電阻值（TEER） 評估上皮完整性；異硫氰酸熒光素-葡聚糖（FD4）透過率評估上皮通透性；透射電鏡觀察細胞間連接及線粒體；蛋白免疫印跡和免疫熒光染色檢測胞質緊密粘連蛋白ZO-1 和緊密連接蛋白CLDN-1 的表達；鐵死亡檢測包括免疫熒光染色檢測細胞內亞鐵離子（Fe2+） 含量；免疫印跡法檢測谷胱甘肽過氧化物酶4 （GPX4）、鐵蛋白重鏈1 （FTH1）、乙酰輔酶A合成酶長鏈家族4 （ACSL4） 的表達，以及測量丙二醛（MDA） 含量和谷胱甘肽比例（GSH%） 評估脂質過氧化水平。結果 與CON組相比，FN組、8%DSS 組和FN+8%DSS 組細胞增殖率降低，細胞損傷增加（Plt;0.05）；與CON組相比，FN組TEER值和FD4 透過率差異無統計學意義（Pgt;0.05）；與8%DSS 組相比，FN+8%DSS 組的6、12、24 h TEER 值下降（Plt;0.05），FD4 透過率增加（Plt;0.000 1）；與CON組相比，FN+8%DSS 組ZO-1 和CLDN-1 蛋白下調（Plt;0.05）；透射電鏡觀察到8%DSS 組細胞間連接破壞，FN+8%DSS 組除了細胞間連接破壞還觀測到F. nucleatum入侵細胞內部，線粒體呈現鐵死亡樣改變；GPX4 蛋白下調，FTH1 和ACSL4 蛋白上調，細胞內Fe2+積聚，MDA升高，GSH%降低。引入Fer-1 和DFO后，細胞損傷降低，TEER 值回升，FD4 透過率降低，ZO-1 和CLDN-1蛋白表達升高（Plt;0.05）。結論 F. nucleatum感染可能通過鐵死亡途徑促進DSS 誘導的體外腸道上皮屏障破壞?！?br>