外周血單個(gè)核細(xì)胞中微小RNA200c-3p、核因子κB mRNA和膜聯(lián)蛋白-5 mRNA對(duì)兒童哮喘診斷價(jià)值的比較研究

［摘 要］目的 比較外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中微小RNA200c-3p（miRNA-200c-3p）、核因子κB（NF-κB）mRNA和膜聯(lián)蛋白-5（ANX-5）mRNA對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值。方法 納入2022年12月至2023年12月間在唐山市婦幼保健院兒科就診的95例哮喘兒童作為哮喘組，并分成輕度組（30例），中度組（36例），重度組（29例），同期來(lái)該院體檢健康兒童40例為對(duì)照組。使用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-200c-3p、NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA的表達(dá)量。測(cè)量肺功能、1s用力呼氣量（FEV₁）、用力肺活量（FVC）、最大呼氣流量（PEF）及FEV₁/FVC值。采用Spearman分析miRNA-200c-3p、NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA與肺功能的相關(guān)性。使用受試者工作特征（ROC）曲線比較miRNA-200c-3p、NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA對(duì)哮喘的診斷價(jià)值。結(jié)果 miRNA-200c-3p和NF-κB mRNA表達(dá)水平在重度組、中度組、輕度組及對(duì)照組間差異顯著（F=12.58和14.81，P＜0.01），并依次降低。ANX-5 mRNA表達(dá)水平在四組間差異顯著（F=16.34，P＜0.01），并依次升高。哮喘患兒?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞中miR-200c-3p和NF-κB mRNA，與FEV₁、PEF、FEV₁/FVC均呈負(fù)相關(guān)（r介于-0.80～-0.48，P＜0.05），ANX-5 mRNA與FEV₁、PEF、FEV₁/FVC呈正相關(guān)（r介于0.48～0.83，P＜0.001）。ROC曲線顯示，外周血PBMCs中miR-200c-3p診斷兒童哮喘的AUC為0.858，敏感度為0.760，特異度為0.893，截?cái)嘀禐?.24，高于NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA單獨(dú)診斷兒童哮喘。結(jié)論 單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-200c-3p對(duì)兒童哮喘的診斷效能優(yōu)于NF-κB mRNA及ANX-5 mRNA單獨(dú)診斷，是兒童哮喘診斷的敏感分子標(biāo)志物。

［關(guān)鍵詞］兒童；哮喘；單個(gè)核細(xì)胞；微小RNA-200c-3p；膜聯(lián)蛋白-5；NF-κB；診斷價(jià)值

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2025.01.008

［中圖分類(lèi)號(hào)］R179 ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1673-5293（2025）01-0044-06

Comparative study on the diagnostic value of miRNA-200c-3p，NF-κB mRNA and

annexin 5 mRNA in peripheral blood mononuclear cells for childhood asthma

WANG Jing，CHENG Liang，WU Jiemei，TIAN Ling，LIU Dandan，ZHAO Yiran

（Department of Pediatrics，Tangshan Maternal and Child Health Hospital，Hebei Tangshan 063000，China）

［Abstract］ Objective To compare the diagnostic value of miRNA-200c-3p，nuclear factor κB （NF-κB） mRNA and annexin 5 （ANX-5） mRNA in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） for childhood asthma. Methods A total of 95 children with asthma who visited the Department of Pediatrics at Tangshan Maternal and Child Health Hospital between December 2022 and December 2023 were included as the asthma group.This group was further divided into a mild group （30 cases），a moderate group （36 cases），and a severe group （29 cases）.Concurrently，40 healthy children who underwent physical examinations at the hospital were selected as the control group.The expression levels of miRNA-200c-3p，NF-κB mRNA，and ANX-5 mRNA in PBMCs were measured using real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR）.Pulmonary function was assessed by measuring forced expiratory volume in 1 second （FEV1），forced vital capacity （FVC），peak expiratory flow （PEF），and the FEV1/FVC ratio.Spearman correlation analysis was used to evaluate the relationships between miRNA-200c-3p，NF-κB mRNA，ANX-5 mRNA，and pulmonary function.The diagnostic value of miRNA-200c-3p，NF-κB mRNA，and ANX-5 mRNA for asthma was compared using receiver operating characteristic （ROC） curve analysis. Results The expression levels of miRNA-200c-3p and NF-κB mRNA differed significantly among the severe，moderate，mild，and control groups （F=12.58 and 14.81，respectively，P＜0.01），decreasing sequentially across the groups.In contrast，ANX-5 mRNA expression levels showed significant differences among the four groups （F=16.34，P＜0.01），increasing sequentially.In children with asthma，miRNA-200c-3p and NF-κB mRNA were negatively correlated with FEV1，PEF，and FEV1/FVC （r ranging from -0.80 to -0.48，P＜0.05），while ANX-5 mRNA was positively correlated with FEV1，PEF，and FEV1/FVC （r ranging from 0.48 to 0.83，P＜0.001）.The ROC curve analysis showed that miRNA-200c-3p in PBMCs had the highest diagnostic value for childhood asthma，with an area under the curve （AUC） of 0.858，sensitivity of 0.760，specificity of 0.893，and a cutoff value of 2.24，outperforming NF-κB mRNA and ANX-5 mRNA as standalone diagnostic markers. Conclusion miRNA-200c-3p in mononuclear cells demonstrates superior diagnostic performance for childhood asthma compared to NF-κB mRNA and ANX-5 mRNA alone，making it a sensitive molecular biomarker for the diagnosis of childhood asthma.

［Key words］ child；asthma;peripheral blood mononuclear cell;miRNA-200c-3p;annexin 5;NF- κB;diagnostic value

哮喘是一種慢性呼吸道疾病，其特征是發(fā)作性和可逆性的喘息、胸悶、呼吸急促和咳嗽^［1］。根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心的報(bào)告^［2］，美國(guó)18歲以下兒童哮喘總患病率為8.3%。與成人相比，患有嚴(yán)重哮喘的兒童嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量、過(guò)敏原敏感性和IgE水平明顯更高^［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是人體組織內(nèi)廣泛存在的可參與炎癥過(guò)程的RNA分子。最近研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血清中多種miRNA存在差異性表達(dá)，并參與哮喘氣道慢性炎癥進(jìn)展^［4］。miRNA-200c-3p是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，定位于3號(hào)染色體上，功能研究顯示在急性呼吸窘迫綜合征患者的肺泡灌洗液和血清中均發(fā)現(xiàn)miRNA-200c-3p濃度增加，是參與肺部炎癥、免疫反應(yīng)、肺泡損傷和修復(fù)的重要miRNA分子之一^［5］。膜聯(lián)蛋白-5（annexin 5，ANX-5）是膜聯(lián)蛋白家族中最小的成員，具有獨(dú)特的膜結(jié)合和自組裝成有序二維陣列的特性^［6］，其可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、肺纖維化^［7］等多種生理過(guò)程。文獻(xiàn)^［8］報(bào)道ANX-5對(duì)兒童哮喘診斷也有一定的診斷價(jià)值。NF-κB信號(hào)通路的激活與氣道炎癥密切相關(guān)，在哮喘發(fā)病機(jī)制中也起著重要的作用^［9］。目前尚鮮見(jiàn)報(bào)道關(guān)于微小RNA-200c-3p（microRNA-200c-3p，miRNA-200c-3p）、膜聯(lián)蛋白-5及核因子κB（nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB）對(duì)兒童哮喘診斷價(jià)值的比較。本研究旨在分析miRNA-200c-3p、ANX-5及NF-κB在兒童哮喘外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)差異，并比較三者對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象及分組

選取2022年12月至2023年12月間在唐山市婦幼保健院兒科就診的95例哮喘兒童，為哮喘組，其中男童50例、女童45例，年齡（8.3±1.8）歲，根據(jù)哮喘嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)指南^［10］分成輕度組（30例），中度組（36例），重度組（29例）。另選取同期來(lái)該院體檢健康兒童40例，為對(duì)照組，其中22例男童、18例女童，年齡（8.3±1.9）歲。四組一般資料比較差異不顯著，見(jiàn)表1。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①按《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)^［10］；②入選患兒在72小時(shí)內(nèi)未使用抗膽堿能類(lèi)、β2受體激動(dòng)劑、白三烯拮抗劑或糖皮質(zhì)激素等哮喘治療藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者；②患者臨床資料不全者；③患者家拒絕參與研究者。選擇同期年齡和性別匹配的健康體檢兒童作為對(duì)照組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2021-022-01），符合醫(yī)學(xué)倫理規(guī)則和要求。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集和處理

采集輕度、中度及重度組哮喘患兒和對(duì)照組兒童體檢期間空腹靜脈血5mL，先使用人淋巴細(xì)胞分離液（cytiva*HyClone公司，貨號(hào)：17-5442-02）分離出靜脈血中的淋巴細(xì)胞，并按4 000r/min的標(biāo)準(zhǔn)離心處理30min，試管底部即人單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），經(jīng)漂洗后以1×10⁵/mL細(xì)胞計(jì)數(shù)加至12孔板，并在37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，并孵育2h，收集細(xì)胞待下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-200c-3p、NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA表達(dá)量的檢測(cè)

提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)11756500）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）法測(cè)定miR-200c-3p、NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA的表達(dá)量。miR-200c-3p采用U6作為內(nèi)參，NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA的測(cè)定采用β-actin作為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表2，反應(yīng)體系：20μL：10μL SYBR premix Ex Taq^TM（2x）、2μL PCR Forward Primer（5μmol/L）、2μL PCR Reverse Primer（5μmol/L）、2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和4μL RNA聚合酶水。反應(yīng)條件：95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。2^-ΔΔCt法用于確定目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3肺功能檢測(cè)

使用兒科肺量計(jì)（德國(guó)MS-IOS JAEGER型）檢測(cè)哮喘組及對(duì)照組兒童肺功能，氣壓計(jì)測(cè)量1s用力呼氣量（forced expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV₁）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、最大呼氣流量（peak expiratory flow，PEF），并計(jì)算FEV1/FVC比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用graphpad 17.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示計(jì)量資料，Levene檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)方差齊性，多組間的比較采用單因素方差分析，在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上用LSD-t檢驗(yàn)行兩組間的比較，相關(guān)性分析采用Spearman分析，對(duì)哮喘診斷的分析采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。

2結(jié)果

2.1四組間外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-200c-3p、NF-κB mRNA和ANX-5 mRNA表達(dá)水平比較

miRNA-200c-3p表達(dá)水平在重度組、中度組、輕度組及對(duì)照組間差異顯著（F=12.58，P＜0.01），重度組、中度組、輕度組和對(duì)照組依次降低；NF-κB mRNA表達(dá)水平在四組間存在顯著差異（F=14.81，P＜0.01），重度組、中度組、輕度組和對(duì)照組依次降低；ANX-5 mRNA表達(dá)水平在四組間存在顯著差異（F=16.34，P＜0.01），重度組、中度組、輕度組和對(duì)照組依次升高，見(jiàn)表3。

2.2 哮喘患兒PBMCs中miRNA-200c-3p、NF-κB和ANX-5及肺功能的相關(guān)性

哮喘患兒外周血PBMCs中miRNA-200c-3p表達(dá)水平與NF-κB mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.66，P＜0.01），miRNA-200c-3p與ANX-5 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.36，P＜0.01），ANX-5 mRNA和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.34，P＜0.01）。

哮喘患兒PBMCs中miR-200c-3p與FEV₁、PEF、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r介于-0.59～-0.48，P＜0.01），NF-κB與FEV₁、PEF、FEV₁/FVC呈負(fù)相關(guān)（r介于-0.80～-0.51，P＜0.05），ANX-5 mRNA與FEV₁、PEF、FEV₁/FVC呈正相關(guān)（r介于0.48～0.83，P＜0.01），見(jiàn)表4。

2.3 PBMCs中miRNA-200c-3p、NF-κB和ANX-5表達(dá)水平對(duì)哮喘的診斷價(jià)值

ROC曲線示，外周循環(huán)中PBMCs NF-κB mRNA表達(dá)水平診斷兒童哮喘的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.658，95%CI為0.609～0.717，敏感度為0.619，特異度為0.603，截?cái)嘀禐?.21；PBMCs中ANX-5 mRNA表達(dá)水平診斷兒童哮喘的AUC為0.731，95%CI為0.633～0.789，敏感度為0.745，特異度為0.779，截?cái)嘀禐?.27；外周血PBMCs中miR-200c-3p診斷兒童哮喘的AUC為0.858，95%CI為0.761～0.877，敏感度為0.760，特異度為0.893，截?cái)嘀禐?.24，見(jiàn)表5和圖1。

3討論

3.1 miRNA在兒童哮喘發(fā)病中的作用

兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的氣道變態(tài)反應(yīng)性和重塑^［11］。及時(shí)診斷和規(guī)范治療對(duì)于減少哮喘反復(fù)急性發(fā)作、預(yù)防氣道重塑和肺功能不可逆損害至關(guān)重要^［12］。因此，尋找與兒童哮喘診斷和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物是臨床急需解決的難題。

miRNA在支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用^［13］。研究發(fā)現(xiàn)^［14］，與健康對(duì)照者相比，支氣管哮喘患者血清中含有53種差異表達(dá)（其中18種表達(dá)下調(diào)，35種表達(dá)上調(diào)）miRNA。另外，循環(huán)中的miR-223-5p、miR-339-3p和miR-454-3p被認(rèn)為是預(yù)測(cè)兒童哮喘急性發(fā)作的重要標(biāo)志物^［15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-200c-3p表達(dá)水平在重度組、中度組、輕度組及對(duì)照組間差異顯著，且重度組中最高，提示miRNA-200c-3p可能參與了哮喘的急性發(fā)作過(guò)程。此外，本研究顯示哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-200c-3p表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，提示其可能反映哮喘患兒肺功能受損程度。

3.2 ANX-5與哮喘發(fā)病的關(guān)系

ANX-5是Annexin家族中最小的成員，在膜表面具有獨(dú)特的膜結(jié)合和自組裝成有序二維陣列的特性^［7］。作為一種在多種細(xì)胞類(lèi)型中普遍表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白，ANX-5對(duì)磷脂酰絲氨酸具有特定的結(jié)合親和力，且會(huì)干擾巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別，減弱胞吞作用^［16］，從而發(fā)揮抑制炎癥和炎癥因子釋放的作用。本研究發(fā)現(xiàn)ANX-5 mRNA表達(dá)水平在在重度組、中度組、輕度組及對(duì)照組間差異顯著，且重度組中最低，提示ANX-5可能參與了哮喘的急性發(fā)作的過(guò)程。本研究后續(xù)研究還顯示，哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞ANX-5 mRNA與FEV₁、PEF、FEV₁/FVC呈正相關(guān)，表明ANX-5 mRNA表達(dá)水平越低，肺功能受損程度越重。

3.3 細(xì)胞因子與哮喘發(fā)病的關(guān)系

哮喘發(fā)病機(jī)制涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與，其中NF-κB激活途徑是目前研究較為深入的領(lǐng)域。NF-κB激活可誘導(dǎo)的多種細(xì)胞因子［腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13］、生長(zhǎng)因子、粘附因子及其受體均參與哮喘發(fā)病的分子機(jī)制^［17］。在本研究中，重度組哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中NF-κB mRNA表達(dá)較中度及輕度組顯著升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其與與FEV1、PEF、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，與過(guò)去研究一致，顯示NF-κB激活是參與哮喘發(fā)生和進(jìn)展的重要分子機(jī)制^［18］。

在本研究中，NF-κB mRNA表達(dá)水平與Annexin A5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)miRNA-200c-3p表達(dá)水平與NF-κB mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，miRNA-200c-3p與二者是否存在調(diào)控關(guān)系是未來(lái)的研究重點(diǎn)。

3.4 兒童哮喘的診斷標(biāo)志物

兒童哮喘缺乏特異性的診斷標(biāo)志物，本研究發(fā)現(xiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-200c-3p水平診斷兒童哮喘的AUC為0.858，95%CI為0.761～0.877，敏感度為76.0%，特異度為89.3%，其診斷效能高于NF-κB mRNA及ANX-5 mRNA。相關(guān)文獻(xiàn)^［19］報(bào)道m(xù)iR-21、miR-55、miR-106a表達(dá)水平在哮喘和過(guò)敏性鼻炎中存在顯著差異，可能作為哮喘的診斷標(biāo)志物。近期研究^［20］選取血清中5種不同的miRNA診斷哮喘和非哮喘的患者，結(jié)果AUC為0.92，顯示出其作為標(biāo)志物的潛力，上述研究結(jié)果均表明，檢測(cè)患者循環(huán)或外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA表達(dá)可能為哮喘診斷的非侵入性的分子標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)重度哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-200c-3p、NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著高于輕度及中度哮喘患兒，ANX-5 mRNA表達(dá)水平隨著哮喘程度加重而顯著降低，單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-200c-3p對(duì)兒童哮喘的診斷效能優(yōu)于NF-κB mRNA及ANX-5 mRNA，是兒童哮喘診斷的潛在分子標(biāo)志物。

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［專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：侯 偉］

［中文編輯：牛 惠；英文編輯：李曉雪］