維生素D調節腸道菌群改善孤獨癥譜系障礙兒童臨床癥狀

［摘 要］目的 探討孤獨癥譜系障礙（ASD）兒童不同維生素D（VD）水平與腸道菌群分布特點，通過補充VD治療對其腸道菌群分布調節及對臨床癥狀改善。方法 選取2023年5月至2023年9月就診于西安市人民醫院兒童保健科且符合納入排除標準的ASD兒童77例為研究對象，進行臨床癥狀評估、16S rRNA腸道菌群檢測、血清25-羥維生素D［25（OH）D］水平檢測。按照血清25（OH）D水平將ASD兒童分為維生素D正常組及維生素D不足組，給予不足組VD補充治療3月后完成隨訪復查。采用t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗進行統計分析及生物信息學方法分析菌群差異。結果 不同VD水平ASD兒童Faecalibacterium、Streptococcus、Lachnospira、Dialister、Fenollaria、Agathobaculum、Coprococcus菌群豐度差異有統計學意義（Z=2.141、2.854、-3.054、-2.084、-2.479、-2.003、-2.805，P＜0.05）。VD補充治療前后Lachnospira、Ezakiella及Faecalibacterium豐度差異有統計學意義（Z=3.296、2.668、-3.059，P＜0.05）。維生素D不足組孤獨癥行為評定量表（ABC）、兒童孤獨癥評定量表（CARS）、社交反應量表（SRS）分值（54.26±21.76、33.40±3.86、94.91±22.642）較維生素D正常組高（46.12±19.02、31.94±3.82、93.41±19.92），但無統計學差異（t=0.880、1.370、0.247，P＞0.05）。補充VD治療后ASD兒童ABC、CARS、SRS分值降低，但無統計學差異（t=-0.372、-0.057、-0.809，P＞0.05）。結論 VD不足影響ASD兒童腸道微生態及其臨床癥狀，通過VD補充治療可能通過調節ASD兒童腸道微生態，進而改善其臨床癥狀。

［關鍵詞］孤獨癥譜系障礙；腸道菌群；25-羥維生素D；兒童

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2025.01.013

［中圖分類號］R179 ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2025）01-0074-07

Vitamin D modulation of intestinal microbiota improves clinical symptoms

in children with autism spectrum disorder

REN Jiaojiao¹，ZHANG Qian²，GAO Hong¹，QI Jing¹，BAI Ruibei¹，LI Hongjuan¹，WANG Zhaohui¹

（1.Department of Children’s Health Care，Xi′an People’s Hospital/Xi′an Fourth Hospital，

Shaanxi Xi′an 710004 China;2.Integrated Traditional Chinese and Western Clinical Medicine，

Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shaanxi Xianyang 712099，China）

［Abstract］ Objective To explore the relationship between different levels of vitamin D （VD） and the distribution characteristics of intestinal microbiota in children with autism spectrum disorder （ASD），and investigate the regulation of intestinal microbiota distribution and improvement of clinical symptoms through VD supplementation therapy. Methods 77 children diagnosed with ASD who were admitted to the Department of Children’s Health Care of Xi′an People’s Hospital from May 2023 to September 2023，and who met the inclusion and exclusion criteria，were selected as the study object.Clinical symptom assessment，16S rRNA gut microbiota detection and serum 25-hydroxyvitamin D ［25（OH）D）］level detection were performed.Children with ASD were divided into normal VD group and insufficient VD group according to serum 25（OH）D levels.In the insufficient VD group，follow-up examinations were completed after 3 months of VD supplementation therapy.Statistical analysis and bioinformatics methods were used to analyze the differences in microbiota through t-test，Wilcoxon rank-sum test. Results The differences in the abundance of Faecalibacterium，Streptococcus，Lachnospira，Dialister，Fenollaria，Agathobaculum，and Coprococcus microbiota in ASD children with different VD levels were statistically significant （Z=2.141，2.854，-3.054，-2.084，-2.479，-2.003 and -2.805，respectively，P＜0.05）.The differences in the abundance of Lachnospira，Ezakiella and Faecalibacterium microbiota before and after VD supplementation treatment were statistically significant （Z=3.296，2.668 and -3.059，respectively，P＜0.05）.The autism behavior checklist （ABC），childhood autism rating scale （CARS），and social responsiveness scale （SRS） in the insufficient VD group （54.26±21.76，33.40±3.86 and 94.91±22.642，respectively） were higher than those in the normal VD group （46.12±19.02，31.94±3.82 and 93.41±19.92，respectively），but the differences were not statistically significant （t=0.880，1.370 and 0.247，respectively， P＞0.05）.After VD supplementation therapy，the ABC，CARS and SRS scores in children with ASD decreased，but the differences were not statistically significant （t=-0.372，-0.057 and -0.809，respectively，P＞0.05）. Conclusion VD deficiency can affect the intestinal microbiota and clinical symptoms of children with ASD.VD supplementation therapy may improve clinical symptoms by regulating the gut microbiota in children with ASD.

［Key words］ autism spectrum disorder;intestinal microbiota;25-hydroxyvitamin D;children

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種發生于兒童早期的神經發育障礙性疾病，其主要臨床癥狀包括社交障礙、興趣狹窄、刻板行為以及不同程度的認知損害等^［1］。近年來ASD發病率急劇上升，2023年美國疾控中心發布的數據顯示8歲以下兒童的發病率為1/32^［2］，2020年我國研究報道ASD患病率為0.7%^［3］。

ASD發病機制目前尚不清楚，但越來越多的研究發現腸道菌群在ASD發病中起著重要作用^［4-5］，以及維生素D補充治療可改善ASD核心癥狀^［6］，使維生素D成為ASD發病機制的研究熱點。維生素D是人體重要的脂溶性微量營養素，除調節鈣磷代謝影響骨骼健康外，活性維生素D亦通過調節維生素D受體，影響機體的代謝及免疫，并對腸道菌群起到調節作用^［7］。但維生素D是否可通過調節ASD兒童腸道菌群來改善其臨床癥狀，仍缺乏相關研究報道。

1 研究對象與方法

1.1研究對象

選取2023年5月至2023年9月就診于西安市人民醫院（西安市第四醫院）兒童保健科的ASD兒童為研究對象。納入標準：①年齡3～7歲；②符合《精神障礙診斷與統計手冊（第5版）》的ASD診斷標準，由兩名以上心理行為專業醫師（其中至少有1名副高以上職稱）共同診斷；③漢族。排除標準：①糞便樣本采集前一月內使用各類抗生素及其他對腸道微生物有影響的藥物或干預措施；②有克羅恩病、炎癥性腸病等胃腸道疾病；③合并有代謝性疾病、腦性癱瘓及其他腦器質性疾病。所有入組兒童均由其法定監護人簽署知情同意書，本研究通過西安市人民醫院（西安市第四醫院）倫理委員會批準（20220027）。

1.2研究方法

1.2.1 ASD兒童臨床癥狀評估

測評人員使用兒童孤獨癥評定量表（childhood autism rating scale，CARS）對ASD兒童進行臨床癥狀評估，心理行為醫師使用孤獨癥行為評定量表（autism behavior checklist，ABC）和社交反應量表（social responsiveness scale，SRS）對ASD兒童主要照護人進行訪談式評估。ABC、CARS、SRS分值越高，ASD臨床癥狀越嚴重。

1.2.2 25羥基維生素D［25-hydroxyvitamin D，25（OH）D）］檢測

使用促凝管采集兒童清晨空腹靜脈血3ml，送至西安市人民醫院（西安市第四醫院）優生遺傳代謝實驗室，采用液相色譜串聯質譜法檢測血清25羥基維生素25（OH）D水平。根據25（OH）D將維生素D營養狀況分為維生素D缺乏［25（OH）D＜30nmol/L］、維生素D不足［30nmol/L≤25（OH）D＜50nmol/L］及維生素D正常［25（OH）D≥50nmol/L］^［8］。

1.2.3腸道菌群檢測

糞便樣本采集：留取入組兒童的新鮮糞便樣本，將約200mg糞便置于細菌DNA存儲管中，-80℃儲存留待測序。

質量檢測和16S rRNA基因擴增：對糞便微生物DNA的濃度和純度進行監測，并對合格樣本16S rRNA基因V3-V4區域（338F：5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3′；806R：5′- GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′）進行擴增。使用AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒對擴增子進一步純化和定量。

MiSeq測序：采用Miseq平臺2×150bp雙端測序進行測序，后續進行生物信息學分析。

1.3維生素D補充治療及隨訪

參考《中國兒童維生素D營養相關臨床問題實踐指南》^［8］對于維生素D缺乏及不足患兒給予間斷大劑量維生素D口服（10萬IU/次，1次/月）治療，治療3月后隨訪復查臨床癥狀、檢測25（OH）D水平及腸道菌群。

1.4統計學處理

1.4.1一般臨床資料

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計量資料以x-±s，M（P₂₅，P₇₅）表示，采用獨立樣本或配對樣本t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗進行組間比較分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

1.4.2生物信息學分析

使用Vsearch 2.15（https：//github.com/torognes/vsearch）進行雙端合并、引物切除及質控，Usearch10.0（http：//www.drive5.com/usearch/）進行OUT聚類分析（閾值97%）及物種注釋，線性判別效應值（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）識別組間生物標志物，使用R語言的“ggplot2”包繪圖。

2結果

2.1研究對象納入及隨訪情況

共納入ASD兒童77例（男68例，月齡54±1.64），維生素D不足15例（19.48%），維生素D缺乏1例（1.30%）。因維生素D缺乏者僅1例，故將其與維生素D不足者共同納入維生素D不足組，最終維生素D不足組16例，維生素D正常組61例。維生素D不足組在維生素D補充治療3月后，完成隨訪復查14例，2人失訪（原因：口服抗生素1人、外傷住院1人），見圖1。

2.2不同維生素D水平ASD兒童臨床癥狀

維生素D不足組ABC、CARS、SRS分值高于維生素D正常組，但差異無統計學意義（t=0.880、1.370、0.247，P＞0.05），見表1。

2.3不同維生素D水平ASD兒童腸道菌群多樣性及差異性分析

2.3.1多樣性分析

不同維生素D水平ASD兒童腸道菌群α多樣性（香農指數）及β多樣性分析（基于Bray-Curtis距離的主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA））顯示兩組間物種組成無統計學差異（圖2A：Z=-1.218，P=0.223；圖2B：R²=0.023，P=0.418）。

2.3.2差異性分析

對兩組兒童腸道菌群屬水平相對豐度比較顯示，維生素D不足組Faecalibacterium、Streptococcus相對豐度顯著增高，Lachnospira、Dialister、Fenollaria、Agathobaculum、Coprococcus相對豐度顯著降低（Z=2.141、2.854、-3.054、-2.084、-2.479、-2.003、-2.805，P＜0.05），見圖3A）。LEfSe分析發現，在維生素D正常組腸道優勢菌群為Lachnospira和Coprococcus，維生素D不足組腸道優勢菌群為Streptococcus、Faecalibacterium，見圖3B。

2.4維生素D補充治療前后臨床癥狀比較

維生素D不足組補充治療后復查25（OH）D均≥50nmol/L。維生素D治療后ABC、CARS、SRS分值均較治療前降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.5維生素D治療前后腸道菌群多樣性及差異性分析

2.5.1多樣性分析

維生素D治療前后ASD兒童腸道菌群α多樣性（香農指數）及β多樣性分析（基于Bray-Curtis距離的PCoA）發現兩組間物種組成無統計學差異（圖4A：Z=-1.790，P=0.073；圖4B：R²=0.050，P=0.190）。

2.5.2差異性分析

對維生素D治療前后ASD兒童屬水平腸道菌群相對豐度比較發現，維生素D治療后Lachnospira、Ezakiella相對豐度顯著增高，Faecalibacterium相對豐度顯著降低，差異有統計學意義（Z=3.296、2.668、-3.059，P＜0.05），見圖5A。LEfSe分析發現，維生素D治療前優勢菌群為Ruminococcaceae、Faecalibacterium，維生素D治療后優勢菌群為Ezakiella、Lachnospira，見圖5B。

3討論

3.1維生素D對ASD兒童的影響

ASD兒童維生素D不足/缺乏發生率普遍高于健康兒童，但不同地區存在差異。本研究中ASD兒童維生素D不足/缺乏率（19.48%/1.30%）與海南地區的ASD兒童相當（18.4%/1.7%），低于重慶（49.7%/8.8%）^［9］，其原因可能是本研究樣本采集時間為夏季，白晝長且陽光充足，兒童戶外活動時間增多，維生素D不足/缺乏情況可得到改善，但發生率仍高于我國7歲以下兒童維生素D不足及缺乏的檢出率14.0%^［10］。

在本研究中維生素D不足ASD兒童的臨床癥狀更重，通過補充治療其臨床癥狀得到改善，提示維生素D作為一種人體必需的脂溶性維生素參與ASD的發病機制。這與ASD兒童生長發育不同階段的研究結果一致，胎兒期母親維生素D缺乏與ASD發生風險存在相關性^［11］，新生兒期維生素D水平與ASD發生率存在相關性，幼兒期、學齡前期ASD兒童維生素D水平均低于健康兒童并與其核心癥狀存在相關性^［6，12］。而維生素D參與ASD發生的可能原因包括：①生命早期維生素D缺乏改變大腦的正常發育過程；②維生素D缺乏使大腦中的神經遞質失調；③維生素D缺乏降低身體和大腦的抗氧化能力，使其更容易受到環境和金屬毒性的影響；④維生素D缺乏影響免疫系統及免疫反應，從而影響大腦發育^［13］，但具體作用機制及通路尚不清楚。

3.2維生素D對ASD兒童腸道菌群的調節作用

多樣性分析結果發現不同維生素D水平ASD兒童間腸道菌群物種組成無顯著差異，但在菌群豐度比較中維生素D不足組兒童Peptoniphilaceae、Streptococcaceae、Faecalibacterium相對豐度增高，Lachnospira、Dialister、Fenollaria、Agathobaculum、Coprococcus相對豐度降低，提示ASD兒童腸道菌群結構組成的影響因素可能十分復雜，維生素D可能影響其中一些菌種的物種豐度。而維生素D補充治療后Lachnospira、Ezakiella、Faecalibacterium豐度變化，及維生素D水平正常和補充治療后ASD兒童腸道優勢菌群均包含Lachnospira，驗證了25（OH）D對這些菌種豐度的影響。

維生素D影響ASD兒童腸道菌群豐度^［14］。這些菌群中Lachnospira、Ezakiella為毛螺桿菌科，能夠在分解植物纖維的過程中產生短鏈脂肪酸，如丙酮和丁酸。這些短鏈脂肪酸對人體的腸道健康和能量供應有重要作用，可以促進糖代謝、控制體重及降低結腸癌發生率等^［15］。其中，丁酸可能在ASD的發病機制中起著重要作用^［16］。Rose等^［17］發現在ASD細胞模型中丁酸能夠改善其氧化應激反應從而增強線粒體功能。Kratsman等^［18］則發現丁酸可以調節ASD動物模型的額葉皮質內抑制/興奮基因的轉錄，從而改善其行為癥狀，其作用機制可能是可通過調節TWIK相關的鉀通道-1調節腸黏膜屏障功能，從而改善腸道粘膜通透性、血腦屏障、大腦功能及行為癥狀^［19-20］。而25（OH）D影響Faecalibacterium豐度并非僅出現在ASD兒童中，Thomas等^［21］在老年男性中發現25（OH）D與Faecalibacterium呈負相關，而Singh等^［22］在健康女性中亦發現維生素D補充治療后Faecalibacterium豐度降低，這意味著25（OH）D對不同人群腸道菌群的影響存在共性及特異性。因此，本研究認為維生素D可能通過調節ASD兒童腸道菌群特定物種的相對豐度（Lachnospira、Ezakiella及Faecalibacterium）來改善ASD兒童的臨床癥狀。

3.3小結

本研究的局限性在于樣本收集時間在夏季，這對25（OH）D水平有一定的影響，這也是研究中ASD兒童維生素D不足/缺乏發生率偏低原因，對研究結果產生一定的偏倚。下一步研究將規范樣本采集時間，并增加樣本量，以提供更客觀、準確的數據來評估ASD兒童維生素D不足/缺乏發生率及維生素D治療前后腸道菌群的差異。

綜上，本研究發現維生素D水平不足可影響ASD兒童腸道微生態并加重其臨床癥狀，而維生素D補充治療可能通過影響Lachnospira、Ezakiella及Faecalibacterium菌群相對豐度，對ASD兒童起到一定治療作用。維生素D補充治療調節ASD兒童腸道菌群并改善ASD臨床癥狀，為維生素D參與ASD兒童發病機制的理論研究提供了新的思路。

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［專業責任編輯：劉黎明］

［中文編輯：向婉婉；英文編輯：馮佳圓］