利用熒光素酶報告基因法研究轉(zhuǎn)錄因子USF1結(jié)合調(diào)控馬鹿MicroRNA PC-5p-4811基因啟動子機制

關(guān)鍵詞：USF1；馬鹿；MicroRNA PC-5p-4811；啟動子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

在哺乳動物中，鹿科（Cervidae）動物鹿茸是已知唯一具有周期性再生能力的顱骨附件器官［1］，關(guān)于其發(fā)生與發(fā)育機理的研究在骨發(fā)生和器官級再生領(lǐng)域備受關(guān)注［2］。miRNA是一種內(nèi)源性、進化保守的非編碼RNA，長度約為22個核苷酸［3］，其作用機制通常是通過與靶基因mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，降解或緘默mRNA翻譯，負調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達［4?6］。已有研究表明，miRNAs在維持鹿茸再生過程中的快速生長發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，例如，miR-PC-2869在鹿茸組織中廣泛表達并調(diào)節(jié)細胞增殖［7］；miR-1、miR-200b-3p和miR-94可能對鹿茸快速生長發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。在前期研究中，項目組在快速生長期馬鹿（Cer?vus elaphus）鹿茸組織中發(fā)現(xiàn)了一種新miRNA：microRNAPC-5p-4811（以下簡稱“miR-4811”）［9］。在進行miR-4811下游靶基因的篩選和功能研究的同時，項目組對激活miR-4811 基因轉(zhuǎn)錄的上游機制非常感興趣，該方面研究目前未見任何報道。

上游刺激因子1（upstream stimulatory factor 1，USF1）是一種具有保守度較高堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（b-HLH-LZ）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子［10］，USF1能夠以二聚體的形式與多種基因啟動子區(qū)E-box結(jié)合，從而實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)控作用［11?12］。作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，USF1 在真核生物中廣泛表達，調(diào)控與細胞生長、細胞增殖相關(guān)的多種基因表達，也是哺乳動物晝夜節(jié)律行為的重要調(diào)節(jié)因子［13］。已有研究表明，在Huh7細胞中，USF1可顯著上調(diào)免疫和炎癥反應(yīng)通路的基因，直接與細胞增殖有關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合［14］；在HBL細胞中，USF1還能與ATF4 基因啟動子區(qū)域結(jié)合，激活脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達，增強脂肪酸的氧化和脂肪生成［15］；在DNA損傷時，USF1可調(diào)節(jié)p53蛋白的表達，進而導(dǎo)致細胞周期的暫時停滯［16］。

項目組在對馬鹿miR-4811 基因上游順式作用元件進行分析時，發(fā)現(xiàn)多個USF1潛在結(jié)合位點，由此提出如下問題：miR-4811 基因核心啟動子位于什么區(qū)域？USF1結(jié)合位點與miR-4811 基因核心啟動子在空間分布上具有何種關(guān)系？USF1能否直接結(jié)合并激活miR-4811 基因核心啟動子功能？本研究通過生物信息學(xué)分析與雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炏嘟Y(jié)合，定位miR-4811 的核心啟動子，驗證轉(zhuǎn)錄因子USF1是否通過miR-4811 上游調(diào)控區(qū)域的結(jié)合位點參與miR-4811 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，旨在構(gòu)建基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為后續(xù)探索miR-4811介導(dǎo)鹿茸生長發(fā)育的功能機制研究提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 鹿茸樣品采集與處理

2023年5月，在秦皇島野生動物園選取3歲健康雄性馬鹿個體1只，并采集處于約50 d生長期的鹿茸樣品。在消毒處理后，去除表面茸毛，隨后沿軸向縱切，從剖面分離出軟骨組織層后，切割成長寬高約為0. 5 cm規(guī)格的組織塊，置于冰箱-80 ℃儲存用于下游基因克隆實驗。

1. 2 miR-4811 上游調(diào)控區(qū)域生物信息學(xué)分析

使用BLAST軟件，依據(jù)miR-4811序列，定位其基因在馬鹿參考基因組（NCBI Taxonomy ID：9860）中的位置，選取miR-4811第一個核苷酸為起點上游10 000 bp左右核苷酸序列進行生物信息學(xué)分析（以miRNA-4811第一個堿基為+1，緊鄰的上游第一個堿基為-1）。利用軟件BDGP、Promoter 2. 0、TSSW、PROMPREDICT、FPROM和iProEP預(yù)測核心啟動子，并利用match、P-match、PROMO、AnimalTFDB 3. 0及JASPAR進行轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點預(yù)測。

1. 3 啟動子片段克隆

使用動物組織樣本基因組DNA 提取試劑盒（FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit，南京諾維贊生物科技股份有限公司）從保存的鹿茸軟骨組織中提取DNA，使用NanoDrop One 分光光度計（美國賽默飛有限公司）檢測DNA 提取物的質(zhì)量與濃度，并暫存于-80 ℃，留作啟動子合成的模板。使用軟件Oligo 7設(shè)計PCR克隆引物，并于北京睿博興科有限公司合成，具體信息見表1。按照2 × RapidTaq Master Mix（南京諾維贊生物技術(shù)有限公司）說明書配置PCR反應(yīng)體系，以鹿茸軟骨組織DNA為模板，選取miR-4811 上游調(diào)控序列的-3 378 ～ +73 bp區(qū)域（編號為P1）進行擴增（PCR儀型號SEDI G，香港威泰克有限公司）。PCR 體系包含（20. 0 μL）：DNA模板2. 0 μL、2 × Rapid Taq Master Mix 10. 0 μL、上游和下游引物各1. 5 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃反應(yīng)時間5 min；進行35個擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性 15 s，61 ℃退火 15 s，72 ℃延伸2 min；最后徹底延伸72 ℃，反應(yīng)時間5 min。擴增產(chǎn)物加樣至1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（110 V，35 min）（電泳儀型號PowerPacTM HV，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)型號KETA GL，香港威泰克有限公司），DNA標記為DL5000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）。電泳完畢后使用紫外分析儀（型號WD-9403F，北京六一儀器廠）切取目的條帶，并使用DNA純化試劑盒（南京諾維贊生物科技股份有限公司）回收DNA。

1. 4 啟動子報告基因重組載體構(gòu)建

使用XhoⅠ限制酶單酶切pGL4. 70空載體并回收備用。以1. 3中得到啟動子野生型片段P1（3 451 bp：-3 378 ～ +73 bp）為模板，分別擴增6個啟動子缺失片段：P2（2 231 bp：-3 378 ～ -1 148 bp）、P3（1 500 bp：-2 516 ～ -1 017 bp）、P4（1 182 bp：-3 378 ～ -2 197 bp）、P5（413 bp：-3 378 ～ -2 966 bp）、P6（ 204 bp：-3 378 ～-3 175 bp）和P7（209 bp：-3 174 ～ -2 966 bp）。PCR 反應(yīng)體系、反應(yīng)程序同1. 3，退火溫度見表1。使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒（南京諾維贊生物技術(shù)有限公司）按照說明書所示，將上述7 種不同長度的啟動子與線性化pGL4. 70 載體進行重組。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α 細菌（上海唯地生物技術(shù)有限公司），并于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取菌落進行測序。使用Easy Puree Hi Pure Plasmid Min iPrep Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取質(zhì)粒并測序。

1. 5 USF1 基因表達載體的構(gòu)建

使用總RNA提取試劑盒（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司）提取鹿茸軟骨組織總RNA。使用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾維贊生物科技股份有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于USF1編碼區(qū)域擴增模板。根據(jù)USF1 基因序列（XM_043876938. 1）設(shè)計引物（表1），并在上下游引物分別添加限制性酶BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切位點序列。PCR反應(yīng)試劑體系與擴增程序同1. 3。擴增產(chǎn)物凝膠電泳后切膠回收，并使用BamHⅠ和Xho Ⅰ對pcDNA3. 1 載體和回收產(chǎn)物分別進行雙酶切處理。使用T4 DNA連接酶（大連寶生物工程有限公司）將USF1 CDS區(qū)連接入pcDNA3. 1載體，使用同1. 4部分轉(zhuǎn)化、鋪板和克隆測序等方法，選取制備含有USF1 CDS區(qū)重組表達質(zhì)粒（pcDNA3. 1-USF1）。

1. 6 啟動子重組載體雙熒光素酶活性實驗

使用24孔細胞培養(yǎng)板接種293T細胞（2 × 105 ～4 × 105個/孔），培養(yǎng)至80%匯合時，使用lipo8000轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司）進行瞬時轉(zhuǎn)染。實驗組含有不同長度啟動子片段報告基因重組載體（250 ng），內(nèi)參為pMIR reporter質(zhì)粒（50 ng）；對照組使用等量pGL4. 70空載體。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，使用Dual Lumi雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司）進行熒光素酶活性檢測。在FilterMax F5多功能檢測儀（上海美谷分子儀器有限公司）上分別測定螢火蟲熒光素酶（F 值）和海腎熒光素酶（R 值）的活性，計算各啟動子片段活性。使用GraphPad Prism 軟件（v9. 0）進行t檢驗，若P lt; 0. 05，兩組數(shù)據(jù)間啟動子活性有顯著差異。

1. 7 USF1 結(jié)合并調(diào)節(jié)啟動子活性實驗

使用Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2（南京諾維贊生物科技股份有限公司）對1. 2部分預(yù)測的USF1潛在結(jié)合位點進行點突變。野生型和突變型序列信息見表2，引物信息見表1，PCR擴增體系見說明書，反應(yīng)程序及后續(xù)實驗流程同1. 4中載體構(gòu)建方法。將pcDNA3. 1-USF1 與野生型或者不同突變型重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞。相關(guān)步驟同1. 6，并作稍許改動；對照組使用等量pcDNA3. 1 空載體。實驗組和對照組各收取一孔細胞，利用Westernblotting 檢測USF1 過表達狀態(tài)（6×His，His-TagMonoclonal antibody，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），以GAPDH 為內(nèi)參（GAPDH Polyclonal Antibody RabbitPolyclonal，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。其余細胞用于雙熒光酶活性檢測，實驗步驟及數(shù)據(jù)處理方法同1. 6。

2 結(jié)果與分析

2. 1 miR-4811 上游調(diào)控區(qū)域生物信息學(xué)分析

馬鹿miR-4811 基因定位于20號染色體正鏈第30255202—30255220區(qū)域。對上游-10 000 ～ +80 bp核心啟動子預(yù)測分析結(jié)果見表3，選定-3 378 ～ +73 bp區(qū)域進行啟動子片段擴增并進行截切實驗定位核心啟動子。在該區(qū)域內(nèi)，預(yù)測分析得到轉(zhuǎn)錄因子USF1的潛在結(jié)合位點信息見表2。

2. 2 啟動子片段克隆與缺失片段重組載體構(gòu)建

利用PCR 擴增獲得miR-4811 的上游調(diào)控序列P1（3 451 bp：-3 378 ～ +73 bp）（圖1），擴增子長度與預(yù)測相符合。進一步測序和比對后證實與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列一致。以P1為模板，擴增獲得6個不同長度的啟動子缺失片段：P2（2 231 bp：-3 378 ～-1 148 bp）、P3（1 500 bp：-2 516 ～ -1 017 bp）、P4（1 182 bp：-3 378 ～ -2 197 bp）、P5（413 bp：-3 378 ～-2 966 bp）、P6（204 bp：-3 378 ～ -3 175 bp）和P7（209 bp：-3 174 ～ -2 966 bp）（圖2）。將各片段連接入pGL4. 70構(gòu)建啟動子報告基因重組載體，KpnⅠ酶切結(jié)果（圖3）證實各重組載體結(jié)果，其中一條較長的片段為pGL4. 70質(zhì)粒，長度3 522 bp；另一條酶切后長度遞減的為啟動子片段，長度分別為3 451、2 231、1 500、1 182、413、204、209 bp。P1 重組質(zhì)粒酶切顯示只有一條帶，原因在于P1序列為3 451 bp，與pGl4. 70空載體序列3 522 bp長度接近，在電泳圖中位置重合無法區(qū)分。測序結(jié)果證實7條不同長度啟動子片段與設(shè)計序列完全相同。雙熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

2. 3 轉(zhuǎn)錄因子USF1 表達載體構(gòu)建

USF1 基因CDS區(qū)克隆擴增片段長度約930 bp，電泳結(jié)果顯示與目的條帶長度相符（圖4A）。測序和比對結(jié)果進一步證實該片段與馬鹿USF1 CDS區(qū)TAA終止密碼子上游的編碼序列完全一致。在設(shè)計擴增產(chǎn)物引物時，已經(jīng)考慮并去除了CDS區(qū)的TAA終止密碼子。將USF1 連接入pcDNA3. 1載體，獲得的pcDNA3. 1-USF1載體經(jīng)雙酶切和測序比對證實序列無誤，酶切電泳后有2條帶（圖4B），較長條帶是酶切后的pcDNA3. 1空載體（5 449 bp），短條帶為USF1基因CDS序列。該載體可表達帶有6 × His標簽的USF1多肽。

2. 4 啟動子活性分析及核心啟動子區(qū)的確定

將其中不同長度的啟動子雙熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，檢測結(jié)果顯示（圖5）對照組pGL4. 70空質(zhì)粒活性約為0，啟動子P1報告基因載體熒光素酶活性顯著高于pGL4. 70 空載，預(yù)示可以進行后續(xù)截切實現(xiàn)核心啟動子的定位篩選。啟動子載體P5活性顯著高于P4，說明在截去的缺失片段-2 965 ～ -2 197 bp中存在著負調(diào)控區(qū)域，抑制著啟動子活性的表達。P6載體的啟動子活性趨近于0，與空載體一致，即啟動子片段P5（-3 378 ～-2 966 bp）截短到P6（-3 378 ～ -3 175 bp）時，啟動子活性消失，提示缺失的-3 174 ～ -2 966 bp區(qū)域存在核心啟動子。構(gòu)建啟動子雙熒光素酶報告基因載體P7（209 bp：-3 174 ～ -2 966 bp），經(jīng)檢測其雙熒光素酶活性在所有的啟動子重組載體中最強，進一步確定核心啟動子位于該區(qū)域。啟動子P7載體活性顯著高于P5，截去的啟動子片段P6（-3 378 bp ～ -3 175 bp）中存在負調(diào)控區(qū)域，抑制啟動子活性。

2. 5 共轉(zhuǎn)染驗證USF1 可結(jié)合并調(diào)控miR-4811 啟動子活性

為驗證pcDNA3. 1-USF1 載體轉(zhuǎn)染后是否過表達，將USF1表達載體與等量pcDNA3. 1空載體轉(zhuǎn)染到293T細胞中進行Western blotting實驗，結(jié)果證實USF1可在細胞中成功表達（圖6A）。為驗證USF1對miR-4811 啟動子區(qū)域的調(diào)控作用，將USF1轉(zhuǎn)錄因子表達載體與pGL4. 70-P7啟動子載體、pMIR reporter內(nèi)參質(zhì)粒等比共轉(zhuǎn)染到293T 細胞中，轉(zhuǎn)染等量的pcDNA3. 1空載體作為轉(zhuǎn)錄因子的對照組，培養(yǎng)24 h后進行雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示USF1顯著上調(diào)pGL4. 70-P7 活性（P lt; 0. 000 1）（圖6B）。提示USF1對于miR-4811轉(zhuǎn)錄具有激活因子功能。進一步將USF1和其結(jié)合位點突變型重組載體P7-U1，P7-U2共轉(zhuǎn)染，對照野生型重組載體pGL4. 70-P7，突變型載體雙熒光素酶活性均顯著下調(diào)（P lt; 0. 000 1）（圖7），佐證了上述2個位點是轉(zhuǎn)錄因子USF1直接結(jié)合位點。

3 討論

在哺乳動物體內(nèi)，作為表觀遺傳學(xué)一個重要的組成部分，miRNA能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達，參與機體生長發(fā)育，甚至病理發(fā)生等過程。對于miRNA，目前研究更側(cè)重于miRNA下游靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、機制和功能研究，對miRNA基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究還很少［17］。項目組前期通過綜合使用生物信息學(xué)和實驗驗證手段，已經(jīng)初步篩選出miR-4811部分真實靶基因，包括ARFGEF2、C1ORF144、C1ORF83、CALD1、MORF4L2、CCDC92、YAF2 和ZNF304，并對miR-4811靶基因下游的互作網(wǎng)絡(luò)、信號通路及功能進行了生信分析和實驗驗證，部分結(jié)果為我們深入理解馬鹿鹿茸特異性表達的miR及其功能提供了重要信息［18］。miR-4811 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機理是亟待要解決的科學(xué)問題，這對于理解非編碼RNA乃至表觀遺傳調(diào)控如何參與調(diào)控鹿茸器官再生具有重要意義。針對這個問題，本研究進行了嘗試，初步揭示了轉(zhuǎn)錄因子USF1的機制和功能，為后續(xù)深入探究奠定了基礎(chǔ)。

啟動子是位于基因上游區(qū)域的關(guān)鍵性順式作用元件，其中核心啟動子部分是可以與RNA聚合酶特異性結(jié)合，起始和調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄，被認為是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心組成部分［19］。miRNA 基因的正確轉(zhuǎn)錄表達受到一個復(fù)雜調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子與啟動子中調(diào)節(jié)啟動子區(qū)域的互動是整個調(diào)控體系中至關(guān)重要的一環(huán)。外部環(huán)境的各種刺激以及不同發(fā)育階段的信號會導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件相互作用，激活或抑制miRNAs 的轉(zhuǎn)錄進程。因此，在miRNAs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中必不可少的一環(huán)就是篩選驗證與上游啟動子關(guān)鍵序列位點存在相互作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白并分析其功能［20?21］。在本研究中，通過綜合使用干濕實驗的方法，分別確定了核心啟動子和USF1結(jié)合的調(diào)節(jié)啟動子區(qū)域。非常有趣的是，這兩個區(qū)域存在重疊。這提示USF1可能與RNA聚合酶存在互作，參與介導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合核心啟動子，此問題值得深入研究和驗證。

不同于常見的EMSA、足跡法等研究策略，本研究選擇了雙熒光素酶報告基因法來揭示核心啟動子位置以及USF1結(jié)合啟動子的機制。通過將靶標基因的啟動子區(qū)域構(gòu)建至雙熒光素酶報告基因表達載體中，檢測雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)熒光蛋白的酶活，從而分析目的基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，這是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中當前最有效的研究手段之一［22］。本研究構(gòu)建了7個不同長度的啟動子截短報告基因載體，分析發(fā)現(xiàn)核心啟動子位于上游調(diào)控區(qū)域-3 174 ～-2 966 bp，進一步結(jié)合基于突變的loss-of-function功能實驗，有力地驗證了USF1參與miR-4811轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制：通過直接結(jié)合核心啟動子中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點對miR-4811轉(zhuǎn)錄進行正調(diào)控。值得注意的是，已有研究證實，在HeLa細胞中，USF1可以上調(diào)位于內(nèi)含子的miR-483 基因表達，而不影響宿主基因IGF2，由于啟動子區(qū)域缺乏相應(yīng)的USF1結(jié)合位點，這種調(diào)控可能是以間接作用的方式實現(xiàn)的［23］。此外，由于轉(zhuǎn)錄因子MYC在結(jié)構(gòu)上擁有與USF1相同的b-HLH-LZ結(jié)構(gòu)，在實驗中常能觀察到2種轉(zhuǎn)錄因子可以對相同的靶基因結(jié)合并產(chǎn)生競爭作用［24］，推測MYC也可以通過且結(jié)合miR-4811 啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點發(fā)揮調(diào)控作用，這一結(jié)果有待進一步實驗證明。

4 結(jié)論

綜上，本研究運用核心啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點生物信息學(xué)預(yù)測分析、基因克隆、點突變和雙熒光素酶報告基因法等技術(shù)，證實馬鹿miR-4811 基因的核心啟動子位于上游-3 174 ～ -2 966 bp之間；轉(zhuǎn)錄因子USF1 在-3 378 ～ +73 bp 區(qū)域共有2 個DNA結(jié)合位點，與miR-4811 核心啟動子重疊；USF1作為激活因子可直接結(jié)合上述位點激活miR-4811 核心啟動子上調(diào)雙熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)錄表達。上述結(jié)論為進一步揭示馬鹿miR-4811 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制和后續(xù)深入探究miR-4811調(diào)控鹿茸再生發(fā)育提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。