添加紅景天苷的全價糧對犬血液生化指標和肝轉錄組學的影響

摘 要： 旨在研究全價糧添加紅景天苷對犬血液和肝轉錄組學的影響，以期為犬的肝養護及肝疾病預防工作提供試驗數據支持。選取10只成年中華田園犬（平均體重 8.67±1.00 kg），隨機分為對照組（n=5）和試驗組（n=5），分別飼喂對照犬糧和紅景天苷全價糧。通過血液檢查來評估紅景天苷全價糧的飼喂效果和安全性，并通過轉錄組學技術探究紅景天苷全價糧對犬潛在的調節機制，試驗期為8周。血液檢查結果顯示，紅景天苷全價糧顯著降低了犬血清谷丙轉氨酶的濃度（Plt;0.05），對其他大部分指標沒有顯著影響（Pgt;0.05），但相比于對照犬糧，采食紅景天苷全價糧的犬血液指標波動小，能保持血液指標的穩定。轉錄組學分析結果顯示，差異表達基因顯著富集在鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路等。針對表型的基因集富集分析結果表明，紅景天苷全價糧在脂代謝、糖代謝、炎癥、氧化應激和纖維化方面起調節作用，其中對于糖脂代謝的調節更顯著，相關信號通路在試驗組顯著上調。綜上所述，紅景天苷全價糧具有降低犬血清谷丙轉氨酶濃度的作用，能夠穩定犬的血液指標濃度，調節了犬的肝糖脂代謝，這可能主要通過調節鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路來實現。

關鍵詞： 紅景天苷；轉錄組學；糖脂代謝；犬

中圖分類號：S858.292"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0455-11

收稿日期：2024-01-02

基金項目：湖北省自然科學基金（2022CFB327）；華中農業大學-中國農業科學院深圳農業基因組研究所合作基金（SZYJY2022008）；“十四五”國家重點研發計劃項目（2023YFD1301000）

作者簡介：王盛琪（1999-），女，黑龍江佳木斯人，碩士，主要從事寵物營養研究，E-mail： KKY@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：齊智利，主要從事寵物營養研究，E-mail： zhiliqi@mail.hzau.edu.cn；張 鑫，主要從事基因工程動物和動物疾病模型的研發及應用，E-mail：zhangxin@gmu.edu.cn

Effects of Salidroside-added Complete Nutrition Food on Blood Biochemical Indexes and

Liver Transcriptomics in Dogs

WANG" Shengqi E-mail： zhiliqi@mail.hzau.edu.cn；ZHANG Xin，E-mail： zhangxin@gmu.edu.cn

肝是動物機體重要的代謝器官，承擔著許多生理功能，包括合成、貯存、分解、排泄、解毒和分泌等^［1］。在臨床病例中，犬類的肝疾病非常常見，3%的犬病都與肝疾病有關，對犬機體的危害十分嚴重，是奪走犬類生命的五大疾病之一^［2］。因此，維護犬肝健康、預防肝疾病發生對于犬的整體健康至關重要。

目前，已有一些具有保肝特性的營養物質被用于寵物食品中作為保護寵物肝功能的營養管理^［3］。紅景天苷（Salidroside）是一種從紅景天（Rhodiola rosea）中提取的天然產物，具有抗疲勞、抗氧化、免疫調節、清除自由基等多種藥理活性。已有研究表明，紅景天苷在改善肝功能方面具有潛在的益處，它能抑制氧化應激和炎癥因子的釋放，從而對肝發揮"" 保護作用，在改善如非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等肝疾病中有很大的應用潛力^［4-5］。然而，雖然有一些關于紅景天苷對人類肝健康的研究，但對于應用在犬的飲食中的研究很少。

紅景天苷全價糧的營養成分經過合理調配，并添加具有護肝作用的紅景天苷，被設計用于維護和促進犬的肝健康。在過去的幾十年里，分子生物學、基因組學和生物信息學的快速發展，使人們能夠更全面地理解生物體內的基因表達和代謝途徑。肝作為一個高度復雜的器官，其功能受到眾多基因和代謝途徑的調控，因此，通過肝臟轉錄組學的研究，可以深入探討這一全價糧對犬肝健康的影響機制。本文將通過試驗研究，評估添加紅景天苷的全價糧對犬血液和肝轉錄組學的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取10只成年中華田園犬，體重（8.67±1.00）kg，隨機分為對照組和試驗組，每組包括5只犬。這兩組分別被飼喂對照犬糧和紅景天苷全價糧（紅景天苷含量為5g·kg^-1）。試驗前，所有犬只在適應性飼養期內進行了1周的環境適應，正式試驗期8周。試驗期內保持正常飼養環境，溫濕度平衡，所有犬只自由飲水。

1.2 試驗儀器與材料

全自動五分類動物血液分析儀（ProCyte Dx， IDEXX， Sysmex Corporation， Kobe， Japan），動物專用全自動生化分析儀（Catalyst One， IDEXX， Westbrook， ME， USA），

對照組犬糧為市售全價配合犬糧，其營養成分范圍為：水分≤10.0%、粗蛋白≥18.0%、粗脂肪≥5.0%、粗纖維≤9.0%、粗灰分≤10.0%、鈣≥0.6%、總磷≥0.8%、賴氨酸≥0.63%、水溶性氯化物（以Cl-計）≥0.09%。紅景天苷全價糧由贛州大健康寵物科學研究院、贛南創新與轉化醫學研究院和江西惠寵科技有限公司聯合研發。

1.3 犬紅景天苷全價糧營養標準

紅景天苷全價糧營養標準符合國家標準《GB／T 31216—2014全價寵物食品——犬糧》和美國飼料管理協會（AAFCO）的要求。所選用的原料和添加劑符合《飼料原料目錄》和《飼料添加劑目錄》的規定。紅景天苷全價糧基礎營養成分檢測值如表1所示。

1.4 樣品采集

1.4.1 血液樣品采集

在試驗的第0周和第8周，通過犬前肢頭靜脈采血，每只犬每次采血2.5 mL。其中，0.5 mL置于EDTA抗凝管內，用于血常規檢測；2 mL血液存放于肝素鋰抗凝管中，離心后取上清液用于血生化檢測。

1.4.2 肝組織樣品采集

在試驗的第8周，使用超聲引導進行肝穿刺活檢，每只試驗犬穿刺7針，以獲得肝組織樣本，于-80℃中保存，用于轉錄組測序。

1.5 指標測定

1.5.1 試驗前基礎生理指標檢測

在進行試驗前，對所有試驗犬進行基礎生理指標檢測，包括體重（kg）、鼻肛體長（cm）、腰圍（cm）、臀圍（cm）、背部皮下脂肪厚度（mm）以及體況評分（Body Condition Scoring，BCS）。

1.5.2 血液指標測定

采集的血液樣本送至惠康動物檢測（武漢）有限公司醫學檢驗實驗室進行血常規和血生化檢測分析，血常規測定指標包括白細胞計數（WBC）、淋巴細胞比例（LYM/%）、單核細胞比例（MON%）、中性粒細胞比例（NEU/%）、嗜酸性粒細胞比例（EOS/%）、嗜堿性粒細胞比例（BAS/%）、紅細胞計數（RBC）和血小板計數（PLT）。血生化測定指標包括谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶（CK）和淀粉酶（AMY）。

1.5.3 肝組織轉錄組學分析

1.5.3.1 總RNA提取和反轉錄：

使用TRIzol法提取犬肝組織RNA，然后按照逆轉錄試劑盒（HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper），Vazyme，Nanjing，China）說明書操作合成cDNA。

1.5.3.2 數據分析：

首先，采用 FastQC v0.12.1對原始數據進行質控，以獲得高質量的clean reads。然后，使用HISAT2 2.2.1將獲得的 clean reads 比對到參考基因組，并通過SAMtools 1.19.2進行排序和去重。最后采用R語言包DESeq2（R4.1.2）進行差異表達基因分析，篩選差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）時使用padjlt;0.05 amp; log2foldchange＞log2（1.5）作為閾值。

1.5.3.3 DEGs功能注釋及富集分析：

首先，基于篩選出的DEGs，通過基因組注釋文件獲得了DEGs的蛋白序列及相關注釋信息。然后，使用homologene包進行物種轉換，將犬的注釋轉換為人的注釋，并采用KEGGannotation將獲得的DEGs的蛋白序列比對到人類蛋白數據庫，以獲得與 DEGS的ENTREZID。最后使用R語言包ClusterProfiler v.4.4.4進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes， KEGG）富集分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。GSEA分析需要計算基因集的ES（enrichment score）值，其反應基因集成員s在排序列表L的兩端富集的程度。計算方式是，從基因集L的第一個基因開始，計算一個累計統計值。當遇到一個落在s里面的基因，則增加統計值。遇到一個不在s里面的基因，則降低統計值。對ES值進行顯著性評估，基于基因集做排列檢驗，計算P值，隨后根據基因集的大小對ES進行標準化，再計算假陽性率，即為校正后的P值。

1.6 數據統計與分析

使用EXCEL 2019軟件對試驗數據進行初步整理，并使用SPSS 23.0軟件對數據進行獨立樣本T檢驗和Mann-Whitney U檢驗。結果以“平均值±標準差”形式表示，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 試驗前犬基礎生理指標檢測結果

試驗前犬基礎生理指標檢測結果如表 兩組犬的體重、鼻肛體長、腰圍、臀圍、背部皮下脂肪厚度和BCS評分均處于相似水平，組間無顯著差異。

2.2 紅景天苷全價糧對犬血液指標的影響

2.2.1 紅景天苷全價糧對犬血液常規檢查指標的影響

血常規指標檢測結果如表3所示，結果顯示，兩組LYM的血液濃度在試驗前存在顯著差異，經過飲食干預后，差異消失。試驗前，兩組犬血中PLT濃度存在極顯著差異，試驗后組間差異消失，但對照組的PLT在第0周和第8周間存在顯著差異，試驗組的PLT血液濃度在試驗前后不存在顯著差異，且差異微小。這說明紅景天苷全價糧比對照犬糧更能維持血中PLT濃度穩定。其他血常規指標在兩組間不存在顯著性差異，說明紅景天苷全價糧不會對血常規指標產生較大影響，而使其保持更穩定的狀態，有利于犬的健康。

2.2.2 紅景天苷全價糧對犬血清生化指標的影響

犬第0周和第8周的血生化指標檢測結果如表4所示。試驗期間，試驗組的ALT血清濃度顯著降低（Plt;0.05），且與對照組間無顯著性差異（Pgt;0.05）。這說明紅景天苷全價糧能夠降低血清中ALT濃度，并與其他正常犬保持相對穩定。試驗期間對照組TG血清濃度顯著下降（Plt;0.05），試驗組保持穩定，未發生顯著變化（Pgt;0.05）。兩組間的CK血清濃度在第0周時存在顯著差異（Plt;0.05），第8周時，對照組的CK顯著下降（Plt;0.05），但試驗組的CK血清濃度保持相對穩定，未產生顯著性變化（Pgt;0.05），同時，對照組的AMY顯著高于試驗組（Plt;0.05），結合對照組第0周時及試驗組試驗前后AMY濃度變化，說明紅景天苷全價糧在穩定血生化指標上起到重要作用。其他血生化指標在兩組間不存在顯著性差異（Pgt;0.05），說明紅景天苷全價糧不會對犬血生化指標產生較大影響，這也可以說明紅景天苷全價糧具有較高的安全性。

2.3 紅景天苷全價糧對犬肝組織轉錄組學的影響

2.3.1 層次聚類分析結果

如圖1所示，兩組樣品分別被聚類到兩簇，說明組內樣品相似度較高，試驗設置的飲食條件是影響聚類的主要因素。

2.3.2 KEGG通路富集分析結果

如圖2所示，KEGG通路富集分析結果顯示前3條顯著富集的信號通路為鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路，每條通路上均有30個以上差異基因富集。前10條內其他顯著富集的通路為cAMP信號通路、PPAR信號通路、胰島素信號通路、胰高血糖素信號通路、cGMP-PKG信號通路、催產素信號通路和Apelin信號通路。

2.3.3 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis， GSEA）

2.3.3.1 表型相關通路富集分析結果：

如圖3所示，在5種表型中顯著富集的通路共有26條。其中，與脂代謝相關的通路有長鏈脂肪酸運輸、脂肪酸β氧化、中性脂質分解代謝過程、脂質氧化、脂肪酸 分解代謝過程、甘油酯分解代謝過程、中性脂質代謝過程、脂質修飾、磷脂代謝過程的調節、脂肪細胞分化的正向調節、肌肉細胞命運定型和短鏈脂肪酸代謝過程；與糖代謝相關的通路有丙酮酸乙酰輔酶的生物合成過程、丙酮酸代謝過程、6 磷酸果糖代謝過程、核苷酸糖生物合成過程和磷酸肌醇介導的信號傳導；與炎癥相關的通路有細胞膜鈣離子運輸、p38MAPK 級聯和調節細胞膜鈣離子濃度；與纖維化相關的通路有細胞外基質組織的正向調節和超分子纖維組織；與氧化應激相關的通路有氧化磷酸化、線粒體電子傳遞細胞色素 c 到氧氣、活性氧生物合成過程的正向調節和對氧水平的反應。

2.3.3.2 表型相關基因富集分析結果：

如圖4所示，在脂代謝相關顯著富集的基因中，FABP4、APOA4、FABP3、FABP1、ADIPOQ等29個基因在試驗組顯著上調，在對照組中顯著下調。在糖代謝相關顯著富集的基因中，FBP2、ALDOA、HK2、ENO3、ME3等30個基因在試驗組顯著上調，在對照組中顯著下調。在氧化應激相關顯著富集的基因中，CAV3、ACTN3、CRYAB、HK2、LIMD1等27個基因在試驗組顯著上調，在對照組中顯著下調。在纖維化相關顯著富集的基因中，CASQ1、LMOD2、CLIP4、PFN2、LOX等22個基因在試驗組顯著上調，在對照組中顯著下調。在炎癥相關顯著富集的基因中，CACNA2D1、GADD45G、ANK2、GADD45A、P2RY1等18個基因在試驗組顯著上調，在對照組中顯著下調。

2.3.3.3 表型相關富集通路上、下調情況：

如圖5所示，5種表型相關富集通路在試驗組顯著上調。脂代謝相關通路中長鏈脂肪酸運輸、脂肪酸β氧化、中性脂質分解代謝過程、脂質氧化、脂肪酸分解代謝過程和短鏈脂肪酸代謝過程信號通路的ES評分完全小于0。糖代謝相關通路中丙酮酸乙酰輔酶的生物合成過程和6 磷酸果糖代謝過程信號通路的ES評分完全小于0。纖維化相關通路中細胞外基質組織的正向調節信號通路的ES評分完全小于0。氧化應激相關通路中氧化磷酸化、線粒體電子傳遞細胞色素 c 到氧氣和活性氧生物合成過程的正向調節信號通路的ES評分完全小于0。

3 討 論

近年來，功能性寵物食品備受人們的關注和認可。這些食品在提供犬貓必需營養素的基礎上，還包含了一些功能性營養物質，能夠為寵物提供額外的健康益處。然而，這些功能性營養物質大多是從人類的功能性食品中發現，而后應用到寵物食品中的，犬貓本身的試驗研究很少^［6］。

本研究使用的紅景天苷全價糧含有的犬易消化的優質蛋白減少肝負擔，低銅含量減少銅在肝內蓄積，從而減少肝細胞的潛在損傷。肝銅蓄積可由銅攝取增加、肝銅代謝原發性缺陷或膽道銅排泄改變引起^［7］。研究表明，肝中過量的銅積累是犬肝炎和肝硬化的原因之一，這一點最先在貝靈頓梗身上得到證實，隨后，肝的銅積累也在其他犬種中被發現^［8］。此外，紅景天苷作為功能性成分的添加可能促進了全價糧在調節糖脂代謝和炎癥反應方面發揮作用。因此，紅景天苷全價糧結合營養成分的科學制備和功能性物質的添加，以期在維持犬肝健康方面發揮重要作用。

試驗前犬基礎生理指標檢測結果顯示，兩組間沒有顯著差異，說明試驗犬在試驗前的健康狀態相似，為后續的研究提供了一個健康的基線。兩組間血常規檢測結果中存在顯著差異的指標為LYM和PLT，然而，需要注意的是，在試驗前，對照組犬這兩種指標濃度較高或較低，在試驗后與試驗組水平一致，而試驗組在試驗前后沒有顯著變化。這說明紅景天苷全價糧有助于維持犬血常規指標相對穩定。血清生化檢查是評估肝損傷程度的常見方法，其中轉氨酶的血清濃度被認為典型的肝損傷生物標志物^［9］。ALT受其他組織的細胞損傷影響很小，對肝細胞損傷具有很高的特異性和靈敏性，血清濃度越高代表肝損傷程度越高^［10］。本試驗中，試驗組犬血清中ALT濃度顯著下降，這表明紅景天苷全價糧有助于降低肝損傷的風險。這可能與紅景天苷的加入有關，研究表明，ALT的血清濃度在一定程度上可以反映肝脂質積累程度^［11-12］，紅景天苷可以有效降低大鼠血清肝酶濃度，調節有關糖脂代謝相關通路中的PI3K等基因的表達^［13］。

通過對犬肝組織進行轉錄組學分析，發現顯著富集的通路主要為鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路。鈣信號通路在各種生物過程中都至關重要，而肝細胞內的信號傳導非常復雜^［14］。關于鎘在大鼠肝細胞中通過 Ca²⁺ 信號傳導誘導細胞毒性的分子機制的研究中發現，鎘主要通過刺激細胞內貯存Ca²⁺的細胞器釋放Ca²⁺和抑制細胞間隙連接通訊（GJIC）來引發細胞內游離 Ca²⁺ 濃度升高，從而造成細胞毒性損傷，而紅景天苷可用于防止鎘誘導的細胞毒性^［15］。PI3K-Akt途徑在代謝、大分子合成和細胞生長、存活、增殖、凋亡等生物過程中發揮重要作用，近年有研究表明其在肝的糖脂代謝過程中也起重要作用^［16］。研究表明，激活PI3K/Akt信號通路能夠抑制下游相關基因的表達，緩解肝的炎癥反應，抑制肝脂肪變性和積累，緩解肝損傷^［17-18］。紅景天苷可以通過靶向 PI3K/AKT/Gsk3-β通路，抑制脂質積累和肝細胞凋亡，促進肝細胞增殖并緩解肝脂肪變性、氧化應激和炎癥反應^［19］。MAPK信號通路通常與肝的炎癥和纖維化的發生有關^［20-21］ 。在肝健康的營養調控中，紅景天苷能夠通過抑制包括MAPK在內的多條信號通路，抑制NLRP3炎癥小體激活，從而緩解肝炎癥^［22］。隨后，本研究對不同表型的基因集進行了富集分析。結果表明，顯著富集通路數量由高到低排列的表型為脂代謝、糖代謝、氧化應激、炎癥和纖維化。結合不同通路上的基因富集情況，可以看出紅景天苷全價糧在調節糖脂代謝方面起到了重要作用。

脂質代謝失調導致的肝細胞脂質積累會產生毒性作用，也稱為脂毒性，會導致具有不同表型和嚴重程度的肝疾病，包括輕度脂肪變性、脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌^［23］。在本次試驗中，脂代謝相關通路主要涉及脂肪酸的運輸及氧化分解代謝，這個過程涉及大量的蛋白質參與。以大鼠為例，研究已經證明肝細胞質膜中的蛋白質在介導脂肪酸轉運方面具有功能性證據，這些研究結果導致了脂肪結合蛋白質（FABPpm）的鑒定^［24-26］。脂肪酰基輔酶A分子的生成通過硫酯化活化CoA來實現，這是長鏈脂肪酸代謝所必需的步驟，該反應由長鏈酰基輔酶A合成酶（ACSL）家族成員催化^［27］。另外，ACC2（ACACB）生成的丙二酰輔酶A通過抑制肉堿棕櫚酰轉移酶1（CPT1）在β氧化中起到關鍵作用，這是脂肪酸代謝中的一個負調節步驟^［28］。CPT1作為脂肪酸氧化過程中的關鍵酶，通過飲食調節在肝中表達量上調，從而調節脂質代謝^［29-30］。這些脂代謝相關基因在試驗組均呈現顯著上調，是兩組間差異顯著性較高的部分基因，可能在紅景天苷全價糧對于犬脂代謝調節過程中起到重要作用。

糖代謝與脂質代謝密切相關。通常情況下，胰島素抵抗伴隨著肝脂肪變性，當發生胰島素抵抗時，高胰島素血癥的作用會抑制脂肪分解，促進脂質合成，同時導致異位脂質的積累，增加了葡萄糖向肝的轉運，從而促進脂質合成，最終導致高脂血癥^［31］。糖脂代謝紊亂通常可以通過飲食進行調節。研究表明，黃芩和黃連的復合物能夠通過調節MAPK/PI3K/Akt信號通路改善II型糖尿病（T2DM）大鼠的葡萄糖和脂質代謝^［32］；還有研究指出，富含多酚的枇杷果實提取物能夠通過調節小鼠的糖脂代謝、氧化應激和炎癥等過程來預防果糖誘導的非酒精性脂肪肝病^［33］。此外，全價糧中添加的紅景天苷也有相關的研究。膳食補充紅景天苷能夠通過AMPK/PI3K/Akt/GSK3β通路顯著降低脂肪肝出血性綜合征蛋雞和糖尿病小鼠的血糖和血清胰島素水平，緩解胰島素抵抗，并改善血脂水平和肝脂肪變性^{［19，34］}。

4 結 論

本研究中，飼喂紅景天苷全價糧的犬只血液大部分指標均保持穩定且沒有顯著性變化，這表明紅景天苷全價糧具有良好的安全性。本研究使用的紅景天苷全價糧對犬的健康產生積極影響，表現為穩定犬血液指標濃度，具有較高安全性，能夠調節犬肝糖脂代謝，這可能與鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路有關。這些發現為開發更健康的犬食品或改善犬的肝健康提供了重要的科學依據。未來可以對這些存在顯著差異的信號通路及基因進行體內或體外試驗，進一步驗證其在犬肝保護過程中起到的關鍵性作用。

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（編輯 范子娟）