表兒茶素沒食子酸酯對MAC-T和小鼠乳腺炎癥與細胞焦亡及NF-κB通路和NLRP3炎性小體的抑制效應

摘 要： 本研究旨在探究表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate， ECG）對牛乳腺上皮細胞NF-κB（nuclear factor kappa B）炎性通路和NOD樣受體3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體的抑制作用。利用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理牛乳腺上皮細胞系（MAC-T）和小鼠乳腺；采用CCK-8法篩選ECG處理MAC-T細胞的最佳濃度，ELISA法檢測促炎因子、氧化應激指示因子以及焦亡指示因子的表達水平；蘇木精-伊紅染色和Annexin V-FITC/PI法檢測小鼠乳腺組織炎性變化和細胞膜破裂情況；Western blot檢測NF-κB、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）、caspase-1和Gasdermin NH 3 端（GSDMD-N）的表達水平；免疫熒光檢測p65核轉移情況。結果發現：1）ECG在10、20、40 mg·kg^-1濃度下均可減輕LPS誘導的乳腺炎癥和炎性細胞浸潤；2）ECG在體內和體外均可顯著且劑量依賴性地降低LPS誘導的促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和氧化應激指示因子（COX-2、iNOS、MPO）表達水平（Plt;0.05）；3）ECG劑量依賴性地降低了LPS誘導的細胞死亡率以及ROS、IL-18和LDH焦亡指示因子表達水平（Plt;0.05）；4）ECG極顯著地抑制LPS誘導的NLRP3、ASC、GSDMD-N、caspase-1、磷酸化p65的表達與核轉移（Plt;0.05）。綜上表明，ECG抑制MAC-T細胞和小鼠乳腺炎癥與細胞焦亡以及NF-κB通路和NLRP3炎性小體。本研究為利用ECG替代抗生素防治牛乳腺炎提供了新的數據。

關鍵詞： 表兒茶素沒食子酸酯；NF-κB；乳腺炎；NLRP3炎性小體；焦亡

中圖分類號： S857.26"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0430-12

收稿日期：2024-01-24

基金項目：國家自然科學基金（32171673）

作者簡介：王浩磊（1999-），男，上海人，碩士生，主要從事動物營養與動物炎癥治療研究，E-mail： yipianche@qq.com；劉夢燕（1998-），女，山西汾陽人，碩士生，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail： 798163059@qq.com。王浩磊和劉夢燕為同等貢獻作者

*通信作者：蔣曹德，主要從事動植物分子遺傳育種與飼料生物技術與加工利用研究，E-mail： jcdpjx@swu.edu.cn；林 濤，主要從事動物營養與動物炎癥治療研究，E-mail： 727826660@qq.com

Inhibition of Epicatechin Gallate on Inflammation and Pyroptosis as Well as NF-κB

Pathway and NLRP3 Inflammasome in MAC-T Cells and Mouse Mammary Glands

WANG" Haolei LIU" Mengyan LONG" Quan LI" Manman L Xiang LIN" Tao 為制約奶牛健康和乳品產業發展的關鍵因素^［1］。乳腺炎主要由微生物感染引起，但是環境因素、人為因素以及牛自身的遺傳因素等也是其誘因^［1］。引起乳腺炎的主要的病原菌包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和鏈球菌（Streptococcus）等，其中大腸桿菌是導致急性臨床乳腺炎最常見的病原菌，它的細胞外膜主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）通過激活核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB）信號通路和NOD樣受體3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎性小體誘發乳腺組織炎性反應和焦亡^［2］。因此，LPS被廣泛應用于多種動物的炎癥模型的建立^［3-5］。

焦亡為依賴于caspase-1和促炎調節的細胞程序性壞死，又稱細胞炎性死亡^［6］。在LPS誘導的焦亡信號通路中，LPS被Toll樣受體4（TLR4）二聚體識別，導致NF-κB的活化與NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎性小體的組裝^［2］，進而通過caspase-1、Gasdermin NH 3端 （GSDMD-N）的作用形成細胞膜穿孔，釋放乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）和IL-1β、IL-18等促炎細胞因子促進炎性疾病的發生^［7-9］。因此，NF-κB和NLRP3炎癥小體在LPS誘導的炎性反應和細胞焦亡中起關鍵作用。

表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate， ECG）是一種重要的類黃酮物質，廣泛存在于茶、葡萄、可可和紅酒中^［10-11］。眾多研究已證實ECG在抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗凋亡等方面具有顯著作用^［12-16］，因此它被用于齲齒、牙周病和動脈粥樣硬化的治療研究^［17-18］。在作用機制方面，研究發現ECG通過阻斷p65的磷酸化來抑制NF-κB的激活，減少NLRP3炎癥小體的形成和IL-1β與TNF-α的釋放，從而緩解小鼠在缺氧環境下的神經炎癥^［13］。同時，ECG抑制絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路，減輕炎癥和細胞凋亡^［14］。最近的研究也表明，ECG抑制NF-κB和MAPK的磷酸化，防止小鼠動脈粥樣硬化的惡化^［18-19］。然而，目前關于ECG的報道大多局限于小鼠和大鼠模型的抗炎和抗凋亡特性，ECG在乳腺炎性反應和焦亡方面的作用有待闡明。

本研究通過LPS刺激MAC-T細胞和小鼠乳腺，探討了ECG對乳腺炎癥與焦亡的抑制作用及其分子機制，為利用ECG替代抗生素防治乳腺炎奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和處理

DMEM培養基（Gibco，蘇州）中加入100 U·mL^-1青霉素、10%胎牛血清和100 μg·mL^-1鏈霉素（Solarbio，北京）。根據需要選擇96孔板或者6孔板，將MAC-T細胞（BNCC，河北廊坊）接種于上述培養基，并在37℃、5% CO 2（Forma Series 3 WJ，Thermo）的培養箱中培養至對數生長期。采用1 μg·mL^-1 LPS^［3-4］和1、15或30 μg·mL^-1 ECG處理MAC-T細胞（ECG的處理濃度根據下述細胞活性檢測確定），并繼續培養24 h。每個處理重復5次，用LPS單獨處理的細胞和LPS+20 μg·mL^-1 地塞米松（dexamethasone，DEX，一種廣泛用于治療炎癥性疾病的類固醇藥物）處理的細胞分別作為ECG處理陰性和陽性對照。

1.2 細胞活性檢測（CCK8）

將重懸的MAC-T細胞接種到96孔板中，每孔100 μL的細胞懸液。待細胞長到90%（2×106細胞·孔^-1），將配制好的ECG原液用不含FBS的DMEM培養基稀釋至0、1、3、6、15、30、60、90、120和200 μg·mL^-1處理細胞，并在處理孔周圍加入100 μL PBS 緩沖液，每個處理5個重復。處理24 h后在每孔加入10 μL CCK-8溶液（Solarbio，北京），培養箱孵育2 h后用酶標儀測定450 nm處的光密度值（OD）。

1.3 動物體內試驗

從恩彼生物技術有限公司（重慶）購買6～8周齡的BALB/c小鼠（18只，♀36只），母鼠每籠2只，公鼠每籠1只，自由采食，在光照/黑暗各12 h的條件下飼養7 d。隨機選取2只母鼠和1只公鼠共同飼養在一個籠子里，進行配種。產后7 d，將成活并泌乳的30只母鼠隨機分為6組，每組5只：空白對照組、LPS組（10 μg·kg^-1）、LPS+ECG（10、20和40 mg·kg^-1）組^［20］，以及LPS+DEX（0.5 mg·kg^-1）組，其中LPS組、LPS+DEX組分別作為ECG處理陰性和陽性對照。注射前將母鼠和子鼠分離2 h后，LPS+DEX和LPS+ECG組進行腹腔注射，空白組和 LPS 組腹腔注射等量生理鹽水。按照前期的方法^［4］，1 h后用2%戊巴比妥鈉（50 mg·kg^-1）麻醉小鼠，將LPS注射到雌鼠的第四對乳頭的乳腺導管中。24 h后當乳腺出現紅腫充血時眼球采血5 mL，注入含有0.1 mL肝素鈉（10 mg·mL^-1 鹽水溶液）的10 mL離心管中，4 ℃，3 000×g離心30 min，收集血清。頸部脫臼法處死小鼠，取出乳房組織，其中一部分置于4%多聚甲醛固定液中，另一部分儲存于-80℃備用。

1.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

細胞在6孔板中培養并按“1.1”方法處理，小鼠按“1.3”方法處理。根據 ELISA試劑盒說明書（博諾恒生物科技有限公司，重慶）測定細胞上清和小鼠血清中炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和氧化應激指示因子（COX-2、iNOS）的含量。

1.5 Western blot

將“1.1”和“1.3”中處理過的細胞和小鼠組織研磨，使用細胞總蛋白提取試劑盒（Solarbio，北京）提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio，北京）進行定量。Western blot按照Ma等^［3］的方法，每個試驗3次重復。所用的一抗包括p65（bs-23217R）、p-p65（bs-0982R）、IκB（bs-1287R0）、p-IκB（bs-2513R）、NLRP3（19771-1-AP）、caspase-1（22915-1-AP）、ASC（10500-1-AP）、GSDMD-N（20770-1-AP）、β-actin（bsm-33036M）（Proteintech，湖北武漢），一抗稀釋比例均為1∶1 000；二抗為 Goat Anti-rabbit IgG/HRP（BS13278；Bioss，北京），稀釋比1∶5 000。膠條使用化學發光ECL-Western blot檢測試劑（Bioground，重慶）進行可視化，并使用Image Lab（版本5.2. Bio-Rad）進行定量。

1.6 免疫熒光

細胞和小鼠處理如“1.1”和“1.3”，按照前期的方法進行GSDMD、NLRP3和p65核轉移免疫熒光檢測^［3-4］。簡而言之，處理過的MAC-T細胞相繼用乙醇孵育10 min，2%的Triton X-100（Beyotime， 重慶）孵育5 min，5%的BSA Block Buffer（Beyotime， 重慶）孵育1 h；分別利用GSDMD、NLRP3以及磷酸化p65（p-p65）的抗體孵育，再用兔抗山羊IgG/Cy3抗體（Bioss， 北京）孵育；使用DAPI對核進行染色，在熒光倒置顯微鏡（Leica， Wetzlar， GER）下觀察。

1.7 Annexin V-FITC/PI分析

將“1.1”處理的MAC-T細胞接種于24孔板，待其生長到90%時，用PBS洗滌3次。按照Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒（翌圣生物科技，上海）說明書在每個培養孔加入10 μL Annexin V-FITC和20 μL PI Staining Solution，避光、室溫反應10～15 min。再加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，1 h內利用熒光倒置顯微鏡（Leica， Wetzlar， GER）進行拍照，并使用Image Lab（版本5.2. Bio-Rad）進行定量。

1.8 蘇木精-伊紅（HE）染色

HE染色由武漢賽維爾生物科技有限公司完成，即將“1.3”方法處理的小鼠R4乳腺組織固定在4%（體積比）的甲醛中，經過脫水、透明化、蠟浸和石蠟包埋后切成5 μm厚的切片。切片進行二甲苯脫蠟（共3缸，5 min·缸^-1）；過無水、90%、80%、70%的乙醇（各1缸，均3 min·缸^-1），蒸餾水再清洗3 min；依次進行蘇木精染色10 min、伊紅染色5 min，經80%、90%和無水乙醇脫水及二甲苯透明化處理后，在生物顯微鏡（Leica， Wetzlar， GER）下觀察組織損傷。

1.9 髓過氧化物酶、活性氧和乳酸脫氫酶檢測

收集“1.1”方法處理的細胞上清和“1.4”方法處理的小鼠血清，按照MPO、ROS檢測試劑盒和LDH活性檢測試劑盒（Solarbio， 北京）說明書，使用Multiskan GO（Thermo， 美國）分別于460、525和450 nm波長處測定MPO（myeloperoxidase）和LDH活性以及ROS（reactive oxygen species）的含量，每次檢測重復3次。

1.10 統計分析

使用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析，并進行Duncan多重比較。統計顯著性設定為Plt;0.05 或 Plt;0.01。

2 結 果

2.1 ECG在MAC-T細胞與小鼠乳腺中的抗炎作用

首先，利用不同濃度的ECG處理MAC-T細胞篩選最佳的處理濃度。CCK-8檢測表明，ECG在1、3、6、15和30 μg·mL^-1濃度下對MAC-T細胞活性無影響；當ECG濃度在60 μg·mL^-1以上時顯著降低了細胞活性（Plt;0.0 圖1A）。因此，在后續研究中采用的ECG濃度梯度為1、15和30 μg·mL^-1。進一步采用ELISA檢測不同濃度ECG處理下MAC-T細胞促炎細胞因子和氧化應激細胞因子的表達變化（圖1B～G）。與對照組相比，受LPS誘導的MAC-T細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的蛋白水平以及MPO活性極顯著增加（Plt;0.01）；但是，ECG處理后上述細胞因子的表達和MPO活性呈劑量依賴性且極顯著降低（Plt;0.01），其中30 μg·mL^-1 ECG處理組的MPO活性極顯著低于DEX處理組（Plt;0.01）。

其次，為了證實ECG體外抗炎效果，分析了ECG對小鼠乳腺炎癥的抑制作用。圖2A顯示，對照組小鼠乳腺組織正常，LPS組小鼠乳腺組織腫脹、充血明顯。HE染色顯示LPS刺激引起腺泡腔充血性水腫，白細胞浸潤；然而，DEX和ECG處理明顯減輕了LPS誘導的乳腺組織病理變化（圖2A、2B）。MPO檢測也證實，ECG處理可極顯著降低LPS誘導的炎癥細胞浸潤（Plt;0.0 圖3A）。進一步分析了ECG對小鼠乳腺組織中促炎細胞因子和氧化應激細胞因子表達的影響。與對照組相比，LPS誘導的MAC-T細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的蛋白水平極顯著增加（Plt;0.01）；但是，ECG處理后這些細胞因子的表達呈劑量依賴性而且極顯著降低（Plt;0.01），其中40 μg·kg^-1 ECG處理組的MPO活性和IL-1β、COX-2的表達極顯著低于DEX處理組（Plt;0.0 圖3B～F）。

2.2 ECG對NF-κB炎性通路的調控

采用Western blot檢測NF-κB兩個關鍵亞基（p65和IκB）的蛋白和磷酸化水平。在MAC-T細胞（圖4A～C），p65和IκB的蛋白水平在不同處理之間沒有顯著差異（Pgt;0.05）；LPS處理的細胞中p-p65和p-IκB 蛋白水平較對照組極顯著增加（Plt;0.01）；在ECG（1、15 和 30 μg·mL^-1）處理的細胞中，p-p65和p-IκB蛋白水平極顯著下降（Plt;0.01）。同樣，ECG（10、20、40 mg·mL^-1）極顯著降低小鼠乳腺組織中p-p65和p-IκB蛋白水平（Plt;0.0 圖4D～F）。在15和30 μg·mL^-1 ECG處理組的MAC-T細胞和20、40 mg·mL^-1 ECG處理的乳腺組織中，p-p65和p-IκB蛋白水平極顯著低于DEX處理組（Plt;0.01）。

采用免疫熒光分析了MAC-T細胞中p65的核移位（圖5A）。結果表明，LPS增強了細胞核p65的熒光信號，而ECG減弱了細胞核p65的信號。MAC-T細胞核p65含量分析也顯示，LPS處理導致核中p65水平極顯著高于對照組（Plt;0.01），ECG劑量依賴性地降低了細胞核p65含量（Plt;0.0 圖5B）。

2.3 ECG對MAC-T細胞和小鼠乳腺焦亡的抑制效應

采用Annexin V-FITC/PI方法檢測各處理組細胞膜破裂情況。與空白對照組相比，LPS組被PI標記的紅色細胞數目增多；但是ECG處理組的紅色細胞數目較LPS組明顯降低（圖6A）。熒光定量分析也表明，ECG各處理組細胞破裂程度均較LPS組極顯著地降低（Plt;0.01），且具有劑量依賴性（圖6B）。

其次，通過檢測細胞焦亡特異指標ROS、LDH和IL-18的表達水平，以進一步證明ECG對LPS誘導的MAC-T細胞焦亡的抑制作用。與空白對照組相比，LPS組MAC-T細胞和小鼠乳腺ROS熒光強度、LDH活性和IL-18水平極顯著增強（Plt;0.0 圖7）；但是，ECG處理劑量依賴性而且極顯著降低了ROS、LDH和IL-18的水平（Plt;0.01）。

2.4 ECG對LPS誘導的NLRP3炎性小體的影響

采用Western blot檢測NLRP3炎性小體相關蛋白的表達水平。與空白對照組相比，LPS 組MAC-T細胞中NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）、caspase-1和GSDMD-N的蛋白水平極顯著提高（Plt;0.0 圖8）；與 LPS處理相比，ECG劑量依賴性地降低上述蛋白的表達水平（Plt;0.01），而且30 μg·mL^-1 ECG處理組細胞中caspase-1、ASC和GSDMD-N表達量極顯著低于DEX處理組（Plt;0.01）。同樣，ECG處理劑量依賴性地降低了小鼠乳腺組織中LPS誘導的上述蛋白的表達水平，且caspase-1、ASC和GSDMD-N表達量極顯著低于DEX處理組（Plt;0.0 圖9）。

3 討 論

作者和其他前期研究報道，1 μg·mL^-1 LPS通過NF-κB和MAPK通路觸發MAC-T細胞的炎性反應^［3-4］，并且通過NLRP3焦亡小體抑制細胞焦亡反應^［7］。另一方面，DEX是一種廣泛用于治療各種急性和慢性炎癥性疾病的藥物，該藥物對LPS誘導的炎癥反應的抑制作用已在小鼠等動物模型中得到廣泛的證實^［3，21］。本研究發現，ECG在≤30 μg·mL^-1的濃度下對MAC-T細胞活性沒有影響，表明對細胞無毒性（圖1A）。基于上述這些數據，并且Esmaeelpanah等^［22］發現10、20和30 mg·kg^-1ECG對丙烯酰胺引起的大鼠神經毒性具有抑制效應，本研究利用LPS刺激MAC-T細胞和小鼠乳腺，并且設計空白對照組、LPS組、LPS + DEX組和LPS + ECG組。通過比較LPS組與空白對照組以揭示LPS誘導的炎性反應，再通過LPS + ECG組與LPS + DEX組、LPS組的比較反映ECG的效應。

很多研究報道炎性因子在乳腺炎發生過程中起著關鍵作用^［3-5］。ECG為兒茶素多酚成分之一，兒茶素多酚還包括表兒茶素（epicatechin， EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin， EGC）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG）^［23］。兒茶素的結構為黃烷-3-醇，由兩個苯環（A環和B環）通過一個二氫吡喃雜環（C環）相連而成，形成C 6-C 3-C 6的結構通式；ECG、EC、EGC和EGCG結構的差異在于羥基數量不同和C環的4’連接的官能團不同，由于它們結構的相似性，均顯示出抗癌、抗炎、抗氧化等方面的重要活性^［23］。特別地，EC和EGCG能夠顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞、MAC-T細胞和大鼠模型中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達^{［3，24-26］}。小鼠上的研究進一步揭示了ECG具有抗動脈粥樣硬化的作用^{［12，18］}。本研究進一步揭示ECG能有效地抑制MAC-T細胞和小鼠乳腺組織中LPS誘導的炎性因子的表達（圖1～3），這與Chen等^［13］的研究結果一致，表明ECG具有抑制乳腺炎癥的作用。

氧化應激通過激活NF-κB促進炎性因子的表達，從而誘導炎癥的發生^［11］。前期研究報道綠茶兒茶素能夠降低肥胖、血壓、低密度脂蛋白膽固醇以及心腦血管疾病風險^［11］，其中EGCG降低缺氧BV2細胞中COX-2、iNOS和MPO的表達^［27］。COX-2由組織損傷部位促炎細胞因子（如IL-1和IL-6）刺激釋放的誘導酶，它催化花生四烯酸產生前列腺素E2來刺激疼痛和炎癥的發生^［28］。iNOS為一氧化氮合酶，被炎性等刺激激活并催化NO的生成，從而促進細胞死亡^［29］。MPO由巨噬細胞和中性粒細胞產生，為氧化應激反應關鍵的介導因子；MPO活性與中性粒細胞的數量成正比，是中性粒細胞浸潤和促炎因子表達的衡量指標^［30］。因此，這些氧化應激指示因子被認為是治療炎癥性疾病和癌癥的重要靶點^［29-30］。本研究發現ECG在體內、體外均能抑制LPS誘導的COX-2、iNOS和MPO的活性（圖1和3），進一步暗示ECG在牛乳腺炎的治療中具有抗氧化和抗炎作用。

細胞焦亡分為經典細胞焦亡通路和非經典細胞焦亡通路^［31-33］。相關研究已證明LPS刺激細胞后，由caspase-1、GSDMD和NLRP3炎癥小體介導感染細胞發生非經典細胞焦亡^［31-32］。然而，細胞的過度或不當焦亡導致組織損傷^［33］。本研究的體內、體外證據表明ECG對LPS誘導的焦亡與NLRP3炎性小體及其相關蛋白水平的的抑制作用（圖6～9）。雖然目前還沒有文獻報道ECG在細胞焦亡調控中的作用，但是前期的研究也表明，EC和EGCG在小鼠肺炎組織、小鼠骨髓來源的巨噬細胞和慢性阻塞性肺病患者中阻止NLRP3炎癥小體和caspase-1的激活^［34-36］；ECG能夠減輕大鼠的炎癥和凋亡^［14］，這些研究報道進一步證實了ECG的抗焦亡作用。

NF-κB是各種生物細胞中廣泛存在的轉錄因子，是LPS誘導炎癥發生的經典信號傳導通路^［37-38］。NF-κB在未受到刺激的靜息狀態下與IκB結合而失活；當LPS等外部刺激出現時，會導致IκB的磷酸化和隨后的泛素化降解，釋放p65進入到細胞核啟動NLRP3、IL-1β和IL-18等靶基因的轉錄^［37-38］。本研究體內和體外結果表明，ECG降低了LPS誘導的p-IκBα和p-p65蛋白水平與細胞核含量（圖4、5）。前期的研究進一步報道ECG抑制ROS、p-IκB、p-p65和TLR4水平^{［13，18］}；EC能夠降低p-IκB和p-p65水平^［3］。這些證據充分證明ECG對NF-κB信號通路的抑制作用。

4 結 論

本研究揭示了ECG可有效減輕LPS誘導的MAC-T細胞和小鼠乳腺炎癥；ECG抑制了MAC-T細胞和小鼠乳腺組織中LPS誘導的炎性和細胞焦亡反應，并且抑制NF-κB通路以及NLRP3炎癥小體及其相關蛋白的表達。今后將進一步研究ECG在抗牛乳腺炎更深層次的分子機制以及在奶牛乳腺炎防治中的應用。

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（編輯 白永平）