豬源大腸桿菌高致病性毒力島結構基因進化分析及其對TNF/NF-κB通路的影響

摘 要： 旨在研究豬源大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）高致病性毒力島（high pathogenicity island，HPI）結構基因的進化趨勢及其對TNF/NF-κB通路的影響。本研究運用MEGA等軟件分析HPI結構基因的遺傳進化，使用R語言功能包挖掘E.coli感染細胞的基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO），并進行差異基因富集分析；使用分子對接預測HPI-Ybt與TNF/NF-κB通路相關蛋白的結合；將E. coli及前期構建的HPI缺陷株E.coliΔHPI感染IPEC-J2細胞，運用qPCR、ELISA和Western blot對TNF/NF-κB通路中的關鍵調控點進行檢測。系統進化樹分析顯示，分離株YUNNAN001的intb基因與GQ891729.1親緣關系最近，而與CQ903045.1親緣關系較遠。KEGG富集發現TNF和NF-κB通路均參與了E. coli感染，且共同基因有10個；火山圖及熱圖富集顯示，E. coli感染顯著促進了TNF/NF-κB通路中PTGS2、NF-κB、TRAF6等的表達（Plt;0.05）；分子對接顯示，HPI-Ybt能與同屬于TNF/NF-κB通路的10個蛋白相結合，其中與MAP3K14、TNFAIP3的結合最強；感染E. coli組的NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6 mRNA水平顯著高于E. coliΔHPI組（Plt;0.01），且相對于E. coliΔHPI組，E. coli組顯著激活了TNF/NF-κB通路蛋白的表達；此外，與E. coliΔHPI組相比，E. coli感染顯著升高了NF-κB和IL-6的水平（Plt;0.01）。結果提示，E. coli-HPI通過合成Ybt結合TNF/NF-κB通路中的關鍵蛋白，進而激活TNF/NF-κB通路。

關鍵詞： 大腸桿菌；高致病性毒力島；耶爾森桿菌素；進化分析；TNF/NF-κB信號通路

中圖分類號： S852.612"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0392-12

收稿日期：2024-03-01

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31960692；31660704）；2021年度云南省研究生優質課程建設項目（2021YJSYZKC05）

作者簡介：王 浩（1996-），男，云南普洱人，博士生，主要從事分子病理學研究；王世玉（1993-），女，云南昭通人，碩士生，主要從事分子病理學研究。王浩和王世玉為同等貢獻作者

*通信作者：高 洪，主要從事分子病理學研究，E-mail： gaohongping@163.com；肖 鵬，主要從事分子病理學研究，E-mail： aipengpengpiao@163.com

Evolutionary Analysis of High Pathogenicity Virulence Island Structure Gene of Escherichia

coli from Pigs and Its Effect on TNF/NF-κB Pathway

WANG" Hao WANG" Shiyu2， XIAO" Jinlong2， SHEN" Jue2， PAN" Tianling2， ZHANG" Jingsong2， XIAO" Peng ， GAO" Hong

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 65020" China;

2.College of Veterinary Medicine， Yunnan Agricultural University， Kunming 65020" China）

Abstract： "This study was designed to study the evolutionary trend of structural genes of high pathogenicity island （HPI） of Escherichia coli （E. coli） and its effect on TNF/NF-κB pathway. In this study， MEGA and other software were used to analyze the genetic evolution of HPI structural genes， and R language function package was used to mine the gene expression omnibus （GEO） of E. coli infected cells， and differential gene enrichment analysis was performed. Molecular docking was used to predict the binding of HPI-Ybt to TNF/NF-κB pathway related proteins. E. coli and the previously constructed HPI deficient strain E. coliΔHPI were infected with IPEC-J2 cells， and qPCR， ELISA and Western blot were used to detect the key regulatory points in TNF/NF-κB pathway. Phylogenetic analysis showed that the intb gene of isolate YUNNAN001 was most closely related to GQ891729. but far from CQ903045.1. KEGG enrichment found that TNF and NF-κB pathways were both involved in E. coli infection， and there were 10 common genes. Volcano plot and heat map enrichment showed that E. coli infection significantly promoted the expression of PTGS2， NF-κB， TRAF6 and other proteins in TNF/NF-κB pathway （Plt;0.05）. Molecular docking showed that HPI-Ybt could bind to 10 proteins belonging to TNF/NF-κB pathway， among which MAP3K14 and TNFAIP3 were the strongest. The mRNA levels of NF-κB， PTGS2， TNF-α， TRAF6， TRIF， ATF4， cxcl2 and IL-6 in E. coli group were significantly higher than those in E. coliΔHPI group （Plt;0.01）， and compared with E. coliΔHPI group， E. coli group significantly activated the expression of TNF/NF-κB pathway proteins. In addition， E. coli infection significantly increased the levels of NF-κB and IL-6 compared with the E. coliΔHPI group （Plt;0.01）. The results suggest that E.coli-HPI activates TNF/NF-κB pathway by synthesizing Ybt and binding to key proteins in TNF/NF-κB pathway.

Key words： Escherichia coli; high pathogenicity island; Yersiniobactin; analysis of evolution; TNF/NF-κB pathway

*Corresponding authors：" GAO Hong， E-mail： gaohongping@163.com; XIAO Peng，E-mail： aipengpengpiao@163.com

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）是引發人類食物中毒和動物疾病的重要食源性病原菌之一，對全球公共衛生具有重要意義^［1］。該菌具有廣泛的感染范圍，可直接或間接在動物與人以及動物與動物之間相互傳播，給畜禽養殖業帶來嚴重的經濟損失，同時也對公共衛生安全構成威脅^［2-3］。高致病性島（high pathogenicity island，HPI）是在耶爾森桿菌中發現的，其功能核心區是通過intb-irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-FyuA基因軸形成的，具有合成、調節和轉運鐵載體-耶爾森桿菌素（Yersiniobactin，Ybt）的能力^［4-5］。盡管最初在耶爾森桿菌中首次報道HPI-Ybt，但在E. coli中也存在，其相似性達98%～100%^［6-7］。HPI僅存在于高毒力菌株中，對細菌的致病性起促進作用，HPI通過合成Ybt與宿主細胞競爭鐵離子，促進其增殖，進而增強其致病力^［8-9］。多項研究表明，含有HPI的E. coli能激活宿主細胞的自噬性死亡和焦亡，促進炎癥反應^［9-10］；并能夠上調豬小腸上皮細胞中TNF-α、IκB-α和IL-1的mRNA水平^［11］；然而，E. coli-Ybt對宿主細胞TNF/NF-κB信號通路的影響目前尚不清楚。

本研究分析了HPI節后基因intb的進化趨勢，并基于生物信息學分析了E. coli感染細胞的基因表達綜合數據庫，同時預測了Ybt與TNF/NF-κB通路相關蛋白的結合能力。隨后，利用qPCR、ELISA和Western blot進一步探討了HPI-Ybt對TNF/NF-κB信號通路的影響，旨在為大腸桿菌的致病機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和細菌

豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；E.coli由云南農業大學動物病理實驗室分離自腹瀉仔豬糞便，并驗證HPI結構完整性^［12］。E.coli ΔHPI為實驗室前期利用CRISPR/Cas9技術所構建^［13］。

1.1.2 主要試劑、儀器

RNAiso Plus（Trizol）、PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、TB Green Premix Ex Taq^TM（TaKaRa），IL-6、NF-κB ELISA檢測試劑盒（Ramp;D Systems），CFX熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Beckman低溫超速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司），核酸蛋白分析儀（德國IMPLEN公司），CO 2培養箱（美國Thermoscientific公司），酶標儀（BioTek公司）。蛋白marker（翌圣生物科技），TNF-α Antibody、NF-κB-p65 Antibody、IKBα Antibody、IL-1βAntibody（Cell Signaling Technology）。

1.2 方法

1.2.1 細胞、細菌培養及大腸桿菌感染細胞

將IPEC-J2細胞復蘇后置于37℃、5% CO 2恒溫培養箱中培養，待細胞密度達到90%以上進行細胞傳代，待細胞傳代至F3代后可用于后續試驗；挑取典型菌落在麥康凱平板上劃線培養，后接種于LB瓊脂固體培養基上，待菌落活化后再接種于LB肉湯培養基，16 h后使用酶標儀測OD 600 "nm值計算菌液濃度。

更換細胞培養孔中的陳舊培養液，按細菌與細胞數之比為10∶1加入細菌，于感染后1、3、5和7 h進行樣本收集。試驗分為3組：E. coli感染組、E. coliΔHPI感染組和空白對照組。

1.2.2 重分析大腸桿菌感染細胞的基因表達綜合數據庫

大腸桿菌感染細胞的微陣列數據從基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫［GEO Accession viewer （nih.gov），GSE15636］下載^［14］。以MINiML文件形式下載原始數據，箱線圖通過boxplot進行繪制，PCA圖通過R軟件包ggord進行繪制。使用R軟件中的limma包研究差異表達的mRNA。在GEO中分析調整后的P值以糾正假陽性結果。“Adjusted P＜0.05且log 2Fold change＞1”被定義為差異顯著。R軟件包中的ClusterProfiler程序用于分析潛在mRNA的KEGG途徑，火山圖、熱圖通過R軟件包Pheatmap進行展示^［15］。

1.2.3 分子對接

TNF/NF-κB通路相關蛋白的三維結構來源于蛋白質數據庫PDBe-KB［PDBe-Knowledge Base （ebi.ac.uk）］；PTGS2：P35354、NFKBIA：P25963、BIRC3：Q13489、NFKB1：Q3V969、TNF：P01375、CXCL2：P19875、TNFAIP3：P21580、MAP3K14：Q99558、TRAF6：Q9Y4K3）^［16］，Ybt的三維結構來源于PubChem CID （CID： 443589）。確定兩個分子的三維結構后，使用CB-Dock2［CB-Dock2： An accurate protein-ligand blind docking tool （labshare.cn）］進行分子對接^［17］，分子對接分數小于-5視為可發生結合。

1.2.4 RT-qPCR檢測TLR4/NF-κB通路相關基因

參照RNAiso Plus（Trizol）說明書提取不同處理組細胞RNA；參照反轉錄試劑盒說明書將抽提的RNA反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測細胞中NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6基因的mRNA水平。以內參基因β-actin為參照，使用2^-ΔΔCt方法計算mRNA相對變化。引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，反應體系20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，模板2 μL，上、下游引物（100 μmol·L^-1）各1 μL，RNase free water 6 μL。熒光定量PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，32個循環。

1.2.5 ELISA檢測炎性因子的分泌

參照NF-κB和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書，檢測各組細胞上清中NF-κB和IL-6的蛋白含量。

1.2.6 Western blot檢測TNF/NF-κB通路相關蛋白

于6 h后收集不同處理的細胞，使用RAPI裂解液提取蛋白，并使用BCA法測定蛋白濃度。樣品進行SDS-page凝膠電泳、轉膜，隨后將PVDF膜放Western blot封閉液封閉0.5 h，加入檢測對應的一抗4 ℃過夜孵育，次日使用種屬對應的二抗室溫下孵育2 h，進行ECL顯色并采集圖像。

1.2.7 HPI結構基因intb進化分析

對實驗室分離保存的HPI陽性菌株用DNA提取試劑盒提取DNA為模板，使用intb引物（F： 5′-GCAGCACCTGAGTAACATAATGC-3′，R： 5′-ACGATATGCGACATTCGCATTTTG-3′）進行PCR擴增，產物為360 bp。PCR體系為2xPCR Mix10 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，水 6 μL，共20 μL。對擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果使用NCBI-BLAST功能進行比對，之后下載相應序列使用Mega6.0軟件繪制進化樹并進行序列比對。

1.2.8 數據統計分析

試驗數據使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析，采用方差分析（ANOVA）或t檢驗分析組間差異，試驗結果用“平均值±標準差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 HPI結構基因intb的進化分析

如圖1A所示，PCR擴增得到360 bp的條帶，與設計的intb基因大小一致。進化樹分析發現本研究菌株YUNNAN001與GQ903040.1 Escherichia coli、GQ891729.1Citrobacterfreundii的遺傳關系較為接近，而與GQ903045.1 Escherichia coli的遺傳關系較遠（圖1B），此外，序列對比發現，菌株YUNNAN001與其他菌株GQ891729.1、GQ891733.1、CBXE 010000231.1、FJ423188.2、BQGU01000230.1的變異度較低（圖1C）。

2.2 TNF/NF-κB通路參與大腸桿菌感染

如圖2A所示，對數據集GSE15636進行標準化，并對6個數據集進行去批次處理（圖2B），2個組間無交集且重復性好。通過KEGG信號通路富集發現（圖2C），TNF通路和NF-κB通路均參與了大腸桿菌感染，并且TNF通路中有28個基因參與，NF-κB通路中有19個基因參與，其中有10個基因同屬于兩條通路（圖2D，圖3A）。通過火山圖和熱圖富集發現大腸桿菌感染顯著上調了TNF通路和NF-κB通路中共同的10個基因（PTGS2、NFKBIA、BIRC3、NFKB1、TNF、CXCL2、TNFAIP3、MAP3K14、TRAF、NFKB2）（圖3E，3B）。通過基因互作網絡分析和表達相關性分析構建了TNF通路和NF-κB中上調的10個基因互作關系（圖1F），且這些基因的表達具有相關性（圖3C）。

2.3 分子對接預測Ybt與TNF/NF-κB通路相關蛋白的結合

使用分子對接軟件預測了Ybt與PTGS2、NFKBIA、BIRC3、NFKB1、TNF、CXCL2、TNFAIP3、MAP3K14、TRAF的相互作用，CB-Dock2預測Ybt與各分子的對接分數，如表2所示，Ybt均能與TNF/NF-κB通路相關蛋白發生結合，其中與MAP3K14、TNFAIP3的結合最強，對接結果分數分別為-8.2和-7.8；圖4顯示了Ybt與TNF/NF-κB通路相關蛋白結合的最優對接結果。

2.4 RT-qPCR檢測

以β-actin基因為內參基因，對E. coli、E. coliΔHPI菌株、空白對照組相應時間點NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6轉錄水平測定，以2^-△△Ct法定量各組目的基因mRNA的水平。結果顯示（圖5），試驗組NF-κB、PTGS2、TNF-α、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6轉錄水平均顯著或極顯著高于對照組（Plt;0.05或Plt;0.01），NF-κB、PTGS2、TRAF6、TRIF、ATF4、cxcl2和IL-6整體呈升高趨勢，各時間段E.coli組均高于或顯著高于E.coliΔHPI組（Plt;0.05），其中TNF-α各時間段E.coli組均低于或顯著低于E.coliΔHPI組（Plt;0.05），并在3 h時達到峰值。

2.5 TNF/NF-κB通路相關蛋白的表達

以GAPDH蛋白為內參蛋白，Western blot檢測各組細胞內TNF/NF-κB通路相關蛋白的表達量。結果顯示：HPI促進了TNF/NF-κB通路的激活，促進了TNF-α、NF-κB-p65、IL-1β的表達，同時抑制了IKBα的表達（圖6）。

2.6 細胞IL-6和NF-κB含量ELISA檢測

經ELISA試劑盒檢測E. coli、E. coliΔHPI菌株感染細胞1、3、5和7 h后IL-6和NF-κB含量，結果顯示（圖7），試驗組IL-6和NF-κB含量均高于或極顯著高于對照組（Plt;0.01），且E. coli組極顯著高于E. coliΔHPI組（Plt;0.01），整體呈升高趨勢，在5 h時達到峰值。

3 討 論

inbt-irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-FyuA基因軸是HPI發揮功能的核心調節部分，通過合成轉運Ybt來增強E. coli-HPI的致病性。本研究對云南豬源E.coli Inbt基因進行了遺傳進化分析，發現與GQ903040.1 Escherichia coli、GQ891729.1Citrobacterfreundii的遺傳關系較為接近，而HPI可以通過水平轉移到其他菌株中^［6-7］，推測本研究分離株的HPI可能來源于同源的Escherichia coli或Citrobacterfreundii。

NF-κB/TNF通路是廣為人知的免疫應答介質，協調各種細胞過程來應對感染和炎癥^［18］。在病原體感染情況下，特別是細菌感染，例如大腸桿菌。激活這一通路對于建立有效的防御至關重要，在大腸桿菌感染過程中，NF-κB通路起到協調宿主反應的關鍵作用^［19］。Ybt是由HPI編碼的一種鐵載體，它能夠與宿主競爭鐵元素的攝取，從而提高細菌在宿主內的存活率，并增強細菌的致病性^［20-21］。先前的研究已經顯示，產Ybt的大腸桿菌在腸道內的黏附、侵襲和定植增加。此外，它還可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路來促進大腸桿菌誘導的細胞自噬^［10］，并且攜帶HPI的大腸桿菌還能夠誘導巨噬細胞焦亡，促進IL-18和IL-1β的釋放^［9］；此外，E. coli-HPI感染會上調豬腸上皮細胞中TNF-α和IL-1的水平，從而加劇炎癥反應，進一步損害了宿主^［11］。NF-κB通路是由各種細胞外刺激啟動的，其中包括促炎細胞因子腫瘤壞死因子，TNF與其受體結合后，會觸發一系列事件，最終導致NF-κB通路的激活^［22］，活化的NF-κB轉位到細胞核，調節許多參與免疫和炎癥反應的基因的轉錄^［23］。差異基因富集分析結果表明，大腸桿菌感染后，TNF通路和NF-κB通路中的10個共同基因（PTGS2、NFKBIA、BIRC3、NFKB1、TNF、CXCL2、TNFAIP3、MAP3K14、TRAF、NFKB2）顯著上調，推測該通路在產Ybt的大腸桿菌引起的感染中也發揮作用。為深入研究Ybt與TLR4/NF-κB通路之間的關系，本研究采用分子對接技術預測了Ybt與NF-κB/TNF信號通路相關蛋白的結合情況。結果顯示，Ybt能夠與TNF/NF-κB通路中的蛋白發生結合，尤其是與MAP3K14和TNFAIP3的結合最為強烈，這種結合可能是Ybt促進NF-κB/TNF信號通路激活的機制，然而這種結合需要進一步的運用表面等離子體共振（surface plasmon resonance， SPR）等技術進行驗證，來確保結果的可信度。

本研究采用E. coli體外感染IPEC-J2細胞模型，研究了E. coliHPI對TNF/NF-κB信號通路的影響。結果表明，大腸桿菌HPI顯著提高了NF-κB/TNF信號通路中相關基因的轉錄和蛋白水平，而感染產HPI缺陷的E. coliΔHPI則顯著降低了這些基因的轉錄和蛋白水平，提示，E. coliHPI激活了TNF/NF-κB信號通路，通過此炎性通路損傷機體。在大腸桿菌感染過程中，NF-κB的激活會導致促炎細胞因子、趨化因子和抗菌肽的生成，這些分子在招募免疫細胞前往感染部位、增強吞噬作用和引發炎癥反應方面起著至關重要的作用。為了驗證這一點，本研究檢測了大腸桿菌感染后細胞培養上清液中IL-6和NF-κB的水平，結果顯示，大腸桿菌感染后，IL-6和NF-κB水平顯著升高，而感染HPI缺陷的E.coliΔHPI后，IL-6和NF-κB水平顯著降低，這與Liu等^［11］的結果相類似。

4 結 論

TNF/NF-κB通路在大腸桿菌HPI致病機制中扮演的關鍵角色，其機制可能是Ybt結合TNF/NF-κB通路中的關鍵蛋白，進而激活IPEC-J2細胞的TNF/NF-κB通路。

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（編輯 白永平）