細粒棘球絳蟲EgM123表面展示型釀酒酵母菌株的構建及免疫原性初步評價

摘 要： 旨在構建并制備細粒棘球絳蟲EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母口服活載體菌株，并初步評價其免疫效果，以期為細粒棘球絳蟲終末宿主釀酒酵母活載體口服疫苗的研發提供理論基礎。克隆細粒棘球絳蟲EgM123基因，構建EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株。誘導培養表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123，并進行體外分析，通過免疫熒光分析以及BCA蛋白定量法對EgM123蛋白進行定位鑒定及定量分析。誘導表達表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123 菌株并免疫BALB/c小鼠。通過檢測小鼠血清中抗體及細胞因子水平變化評價細粒棘球絳蟲EgM123口服酵母活載體菌株的免疫效果。結果成功克隆了細粒棘球絳蟲EgM123的ORF序列，長度為594 bp。PCR檢測以及酶切鑒定結果表明，成功構建EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株。免疫熒光結果顯示，EBY100/pYD1-EgM123表面具有綠色熒光，BCA蛋白定量法測定50 OD 600 nm EBY100/pYD1-EgM123 誘導72 h后蛋白的表達量為15.59 μg，濃度為0.31 μg/OD 600 nm。抗體水平檢測結果表明，EBY100/pYD1-EgM123免疫組特異IgG、IgA、IgM抗體的分泌均高于PBS組、EBY100組及EBY100/pYD1組（P＜0.05）。細胞因子檢測發現，EBY100/pYD1-EgM123免疫組對小鼠細胞因子IL-17、IFN-γ的分泌量顯著加強（P＜0.001）。綜上所述，通過對細粒棘球絳蟲EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母口服活載體菌株免疫效果的初步評價，發現該口服活載體菌株具有免疫原性，可以刺激小鼠產生特異性免疫應答，進一步說明其具有成為終末宿主抗囊型包蟲候選疫苗的潛力。

關鍵詞： 細粒棘球絳蟲；EgM123；表面展示型釀酒酵母；口服疫苗

中圖分類號：S852.734"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0378-14

收稿日期：2024-03-06

基金項目：國家自然科學基金（32360887）；新疆生產建設兵團國際科技合作（2021BC008）；省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室重大專項（2021ZD02）；兵團農業科技創新工程專項（NCG202213）聯合資助

作者簡介：賈新月（1997-），女，遼寧朝陽人，碩士生，主要從事預防獸醫學研究，E-mail：1342991830@qq.com

*通信作者：薄新文，主要從事寄生蟲病防控研究，E-mail： xinwen_bo@126.com；王正榮，主要從事寄生蟲病防控研究，E-mail： wzrtiger@sina.com

Construction and Evaluation of a Surface-displayed Saccharomyces cerevisiae EBY100/PYD1-EgM123 for Echinococcus granulosus

JIA" Xinyue E-mail： xinwen_bo@126.com；WANG Zhengrong，E-mail： wzrtiger@sina.com

囊型包蟲病（cystic echinococcosis，CE）是由細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus， E. granulosus）中絳期幼蟲寄生于人或動物臟器所引起的一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病。目前，該病呈全球性分布，具有重要的社會經濟影響，中國是全球棘球蚴病流行最嚴重的國家之一^［1-3］。2019年，新疆喀什地區對犬進行細粒棘球絳蟲感染情況調查發現牧區感染率為5.12%，農區感染率為2.06%，牧區感染率高于農區^［4］。2020年，新疆尉犁縣犬細粒棘球絳蟲流行率為38.71%^［5］。2021年，阿壩州、甘孜州以及雅安市等川西地區的犬糞樣本進行檢測，細粒棘球絳蟲總感染率為16.5%^［6］。CE對牧區當地的經濟發展及群眾健康的危害十分嚴重，因此CE的防治刻不容緩^［7］。當前，對包蟲病的防控主要包括兩個方面，1）在包蟲病高發區域，對中間宿主牛羊采用Eg95重組亞單位進行免疫預防。該疫苗雖然具有較高的免疫保護效果，但僅對未感染的宿主以及處于“移行期”的宿主有效，一旦形成包囊則無保護作用。2）對終末宿主犬進行“犬犬投藥，月月驅蟲”，該方法雖然有效，但費事費力，在基層難以實施。犬作為細粒棘球絳蟲的傳播源頭，是本病防控的關鍵環節，但截至目前，依然沒有商品化的犬抗細粒棘球絳蟲的疫苗，這嚴重制約了本病的有效防控。因此，研究犬抗細粒棘球絳蟲的疫苗，已成為國內外包蟲病防控研究的重點工作之一。尤其是結合其腸道寄生的特點，研發能充分激活宿主黏膜免疫的口服疫苗必將是細粒棘球絳蟲終末宿主疫苗研發的一個重要方向。

目前，已有很多關于寄生蟲口服疫苗的研究報道，如瘧原蟲^［8］、華枝睪吸蟲^［9］、鏈狀帶絳蟲^［10］等。并且經過很多試驗驗證口服疫苗在預防和治療寄生蟲病方面效果顯著，具有良好的應用前景。Zhang等^［11］從細粒棘球絳蟲鑒定得到EgM123、EgM4、EgM9 3個EgM家族基因。通過多次重組蛋白免疫效果試驗發現EgM123在宿主抵御細粒棘球絳蟲感染有明顯保護作用，包括減少蟲體負荷量、抑制蟲體生長及抑制蟲體繁殖產卵等方面^［12］。Petavy等^［13］將EgTrp和EgA31 2種細粒棘球絳蟲重組蛋白克隆并在減毒沙門氏菌中表達以制備口服疫苗，經口服免疫試驗犬，結果顯示犬蟲體負擔顯著降低70%～80%，結果證明沙門菌口服疫苗EgA31-EgTrp有很好的效果，表明口服疫苗可以作為一種新的預防細粒棘球絳蟲的手段進行研究發展。

釀酒酵母是公認的益生菌，不僅可以刺激機體產生非特異免疫，還沒有其他副作用^［14］。已有很多研究使用酵母作為表達載體，發現其制備的疫苗在抗菌和抗病毒方面具有很好的效果^［15-17］。同時，酵母菌在表達真核生物蛋白方面比細菌等更具優勢，因為其具有類似高等生物的翻譯后修飾機制功能。并且有研究表明，酵母菌的發酵產物具有一定抗球蟲感染的作用^［18］。然而，利用表面展示型釀酒酵母制備抗細粒棘球絳蟲的口服活載體疫苗還未見報道。本研究基于釀酒酵母表面展示系統，克隆EgM123基因并將其與質粒pYD1連接并轉化至釀酒酵母EBY100中以構建表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123菌株，并誘導表達。口服疫苗免疫小鼠，通過小鼠抗體水平和細胞因子水平對細粒棘球絳蟲EgM123口服釀酒酵母菌株的免疫效果進行初步評價。以期為細粒棘球絳蟲EgM123口服疫苗是否具有預防細粒棘球蚴病的潛力提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物倫理申明

本研究涉及的動物試驗得到新疆農墾科學院動物倫理委員會的審查和批準（A2023-006），所有相關試驗動物的所有程序嚴格按照“新疆農墾科學院動物倫理委員會實驗動物護理指南”實施。

1.2 試驗材料與試劑

G1基因型細粒棘球蚴原頭蚴由省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室提供。感染G1基因型細粒棘球絳蟲的犬陽性血清來自本實驗室人工感染細粒棘球絳蟲的試驗犬；犬陰性血清來自健康的試驗犬。6周齡SPF級BALB/c雌性小鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心。

瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；S.cerevisiae EBY100菌株、pYD1質粒購自武漢淼靈生物科技有限公司；超純RNA提取試劑盒、DNA Marker、SDS-PAGE Gel Kit、5×SDS-PAGE上樣緩沖液、廣譜彩虹預染蛋白Marker購自康為世紀生物科技有限公司；RNA反轉錄試劑盒、Phanta "Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自諾唯贊生物科技股份有限公司；pMD^TM19-T Vector Cloning Kit、2×PCR Mix、限制性內切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA Ligase購自寶生物工程大連公司（TaKaRa）；釀酒酵母MD培養基購自艾禮生物科技（上海）有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；酵母細胞壁可溶性總蛋白制備試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；葡萄糖（glucose）、半乳糖（galactose）購自范德（北京）生物科技有限責任公司；兔抗His標簽單克隆抗體、HRP標記的羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗小鼠IgG購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF 膜購自羅氏公司；小鼠白細胞介素17 ELISA試劑盒、小鼠γ干擾素ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 細粒棘球絳蟲原頭蚴總RNA提取及EgM123基因的克隆鑒定

參照動物組織總RNA提取試劑盒說明書指示，提取細粒棘球蚴原頭蚴總RNA。以所提取的原頭蚴總RNA為模板，參照第一鏈cDNA合成預混體系Master Premix說明書將提取的原頭蚴總RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存備用。

參考NCBI GenBank數據庫中細粒棘球絳蟲EgM123（Gene ID： AF482718.1）的CDS序列，使用Primer 5.0軟件設計PCR擴增引物，引物序列為EgM123-F：CGGGATCCGAACCAGTGAATTTTG，EgM123-R：CCCTCGAGTTTCGTCTTTAAGGCAC，擴增片段為594 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以先前反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）：PrimeSTAR Max Premix（2×）10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板 1 μL，超純水 7 μL。PCR反應程序：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，參照通用型DNA純化回收試劑盒說明書指示對目的條帶進行切膠回收。將回收產物與pMD-19-T載體在4℃條件下過夜連接。將連接產物轉化至E. coli DH5α感受態細胞，涂布于含有Amp抗性的LB固體篩選培養基，37℃過夜培養。次日挑取單菌落，接種至1 mL 含有100 μg·mL^-1 Amp的LB液體培養基，37℃ 180 g擴大培養4 h后，進行菌液PCR鑒定。將PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定為陽性的菌株（條帶亮且單一，大小符合目的片段）菌液加入等體積50%甘油混勻送至上海生工生物工程有限公司測序，其余-20℃保存。測序結果與目的序列進行比對。經PCR驗證為陽性且測序正確的菌液擴大培養后進行質粒提取，所提重組質粒命名為pMD19-T-EgM123。

1.4 pYD1-EgM123質粒的構建及S.cerevisiae EBY100酵母感受態細胞的轉化

采用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶分別雙酶切pMD19-T-EgM123和pYD1載體，酶切體系為20 μL，其中目標質粒7 μL，酶切緩沖液 2 μL，BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶各1 μL，ddH 2O 9 μL，在37℃水浴鍋進行1 h雙酶切反應。酶切結束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。將EgM123和pYD1載體切膠回收產物在4℃條件下過夜連接，連接體系為20 μL，其中EgM123 7 μL，pYD1 8 μL，10×連接 Buffer 2 μL，T4 DNA連接酶 1 μL，ddH 2O 2 μL。將連接好的pYD1-EgM123質粒轉化至E. coli DH5α感受態細胞，涂布瓊脂平板挑取單菌落，進行PCR鑒定，PCR鑒定陽性的菌落接種擴大培養，提取重組質粒，并使用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶進行雙酶切鑒定。

將S.cerevisiae EBY100菌株接種于5 mL YPD培養基中30℃，250～300 r·min^-1培養過夜。取適量過夜培養液分別接種于兩瓶50 mL YPD培養基中，250～300 r·min^-1培養16～18 h（OD 600 nm：1.3～1.5）。于4℃ 4 000 g離心收集菌體，用25 mL冰浴的無菌水洗滌一次后，細胞用10 mL冰浴的無菌水重懸，可換成較小的離心管。加入1 mL的10×TE緩沖液（pH 7.5），搖晃均勻，再加入1 mL 10×乙酸鋰，旋轉搖勻，于30℃輕輕搖動45 min。再加入0.4 mL 1 mol·L^-1 DTT，并同時旋轉搖動，于30 ℃輕輕搖動15 min。于4℃，4 000～6 000 g離心，棄上清（用移液槍吸取），再用25 mL冰浴的無菌水洗滌，4℃離心收集菌體。用2.5 mL冰冷的1 mol·L^-1山梨醇重懸細胞，離心收集菌體，棄上清（用槍吸取）。每管用100 μL 1 mol·L^-1山梨醇溶解，分裝于EP管中（100 μL·管^-1），于-80 ℃保存備用。釀酒酵母EBY100感受態細胞已經制備好，可用于接下來的質粒DNA轉化試驗。

取制備好的S. cerevisiae EBY100感受態細胞100 μL于冰上融化，一次加入預冷的pYD1-EgM123質粒2～5 μg，Carrier DNA（95～100℃，5 min，快速冰浴，重復一次）10 μL，pEG/LiAc 500 μL吹打混勻，30℃水浴30 min（15 min時翻轉6～8次）。42℃水浴15 min（7.5 min時翻轉6～8次）。5 000 g離心40 s棄上清，ddH 2O 400 μL重懸，離心30 s，棄上清。ddH 2O 50 μL重懸，涂板于亮氨酸MD固體培養基，30℃培養至菌落長至2～3 nm大小（培養36～48 h）。同時轉化pYD1質粒作陰性對照。

1.5 重組表面展示型釀酒酵母的誘導表達、鑒定

挑取EBY100/pYD1-EgM123的單克隆菌落，接種于含2%的葡萄糖的YNB-CAA液體培養基，30℃，250 g培養12～16 h。檢測OD 600 nm為2.0～5.0。將所述菌液重新接種于含2%半乳糖的YNB-CAA液體培養基，20℃、250 r·min^-1誘導培養72 h。

2%葡萄糖YNB-CAA菌液轉移量計算方法：

假設新用2%半乳糖的YNB-CAA液體培養基10 mL，則：轉移量×OD 600 nm值=（10+轉移量）×0.75

誘導培養期間，分別在第0、12、24、36、48、60、72小時取600 μL菌液10倍稀釋（酶標儀量程最大值有限），通過酶標儀分別測定第0、12、24、36、48、60、72小時的OD 600 "nm值，確定誘導釀酒酵母生長曲線圖。72 h誘導結束后，用于后續的SDS-PAGE分析。同時誘導培養EBY100/pYD1作為陰性對照。

1.6 免疫熒光分析

取半乳糖誘導72 h后的 EBY100/pYD1-EgM123 菌液 2 OD 600" nm，12 000 g 4 ℃離心 5 min，棄上清，保留沉淀。另取半乳糖誘導72 h后的 EBY100/pYD1作為陰性對照。用 500 μL的無菌1×PBS 洗滌沉淀 3次，每次4℃ 6 000 g離心5 min，棄上清。用無菌 PBS 將鼠抗-EgM123多克隆抗體（一抗）稀釋，稀釋比例為 1∶200，在4℃條件下，用500 μL稀釋過的一抗，孵育過夜。回收一抗，洗滌3次。加入500 μL用無菌 PBS 1∶5 000稀釋的 FITC-標記的山羊抗小鼠 IgG，37℃孵育1 h。洗滌3次。菌體懸浮于50 μL無菌 PBS中；取5 μL菌液滴于干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，邊緣涂上透明樹脂固定蓋玻片。在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.7 BCA試劑盒測定蛋白濃度

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明對EBY100/pYD1-EgM123重組蛋白的濃度進行測定。以BSA為蛋白標準品，繪制標準曲線，將待測的蛋白樣品稀釋至合適濃度，加到96孔板中，使待測樣品總體積為20 μL。根據樣品數量，按50體積BCA試劑加1體積硫酸銅溶液（50∶1）配制適量BCA工作液，充分混勻。每孔加入BCA工作液200 μL，充分混勻（可將酶標板放在振蕩器上振蕩30s），37℃放置30 min后，以標準曲線0號為參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。以標準品蛋白含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白含量（μg），除以樣品稀釋液總體積（20 μL），乘以樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度。

1.8 重組EBY100/pYD1-EgM123菌株的口服免疫及抗體檢測

1.8.1 重組EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株的制備

將EBY100/pYD1-EgM123、EBY100/pYD1分別接種于含2%葡萄糖的YNB-CAA液體培養基，30℃ 250 r·min^-1過夜培養。取過夜培養菌液，根據轉接量計算方法，將培養液轉接于新鮮的含2%半乳糖的YNB-CAA液體培養基，20℃ 250 r·min^-1誘導培養72 h。誘導完成后，通過酶標儀測定EBY100/pYD1-EgM123（72 h）、EBY100/pYD1（72 h）的OD 600 nm值。5 000 g4 ℃離心10 min，棄上清收集沉淀，沉淀菌體用無菌PBS漂洗3次。無菌PBS重懸漂洗后的菌體，將其濃度調整OD 600 nm至0. 準備給試驗鼠灌胃免疫。

1.8.2 重組EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株的口服免疫方案

將60只8周齡SPF級雄性BALB/c小鼠隨機分成10組，每組6只，EBY100/pYD1-EgM123為試驗組，EBY100/pYD1為空載體對照組，EBY100為空酵母菌對照組，PBS為陰性對照組，第1天首次免疫，第16天加強免疫，免疫劑量如表1所示。

1.8.3 抗體測定

每次免疫前及第30 天，對小鼠進行眼眶后靜脈叢采血（大約500 μL），4℃靜置12 h。4℃ 2 000 g離心15 min。取上清，保存于-80℃備用。每次免疫前及第30天，取小鼠糞便150 mg溶于300 μL于無菌PBS中，浸泡2 h。劇烈震蕩，使其充分溶解后4℃ 12 000 g離心5 min。取上清，保存于-20℃備用。

從-80℃取出小鼠血清，待其于4℃融化，若出現沉淀需再次離心取上清，使用樣本稀釋液10倍稀釋。用ELISA法檢測小鼠血清中特異性IgG、IgM及小鼠糞便中特異性IgA水平。

1.9 數據處理

抗體、細胞因子檢測數據采用Graph Pad軟件中的獨立樣本T檢驗進行統計學分析，P＜0.05時，組間差異具有統計學意義。并用Graph Pad軟件作圖。

2 結 果

2.1 EgM123基因的PCR擴增以及pYD1-EgM123質粒的酶切鑒定

以E. granulosus原頭蚴cDNA作為模板，PCR擴增EgM123基因，結果在594 bp左右擴增出特異條帶，與預期結果相符，結果見圖1A。

將構建好的pYD1-EgM123質粒進行雙酶切鑒定，酶切產物電泳分析結果顯示，pYD1-EgM123質粒雙酶切分別得到4 961和594 bp的兩條條帶，條帶大小與預期長度一致，結果見圖1B。

2.2 表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123 PCR鑒定

通過PCR對EgM123基因片段是否成功插入S. cerevisiae EBY100進行檢測。所得PCR產物電泳分析如圖2所示。預期所插入的EgM123基因片段長度為594 bp，圖中可見Lane 1顯示在600 bp左右有一單一亮帶，與預期大小一致，說明擴增特異性較高。由PCR鑒定可知，pYD1-EgM123已成功轉化到S. cerevisiae EBY100中。

2.3 重組表面展示型釀酒酵母生長曲線

通過BCA法繪制靶標蛋白的標準曲線，蛋白濃度計算的一次函數為y=1039.32x-90.11。需要測定的目的蛋白濃度為誘導后蛋白濃度減去誘導前蛋白濃度，利用數學方法經一次函數換算后的計算公式為y=1039.32（x 2-x 1），測出的總蛋白濃度為6.235 92 μg·mL^-1；測定濃度時蛋白稀釋5倍，且總共用500 μL萃取液溶解總蛋白，因此提取的50 OD 600nm EBY100/pYD1-EgM123 誘導72 h后蛋白的表達量為15.59 μg，濃度為0.31 μg/OD 600 nm。

為了探究重組表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123的生長情況，通過OD 600 nm值確定其生長曲線，如圖3所示。

2.4 免疫熒光分析

通過免疫熒光分析，可以直觀地說明誘導后的EBY100/pYD1-EgM123將EgM123蛋白成功地展示在釀酒酵母菌表面。結果如圖4所示。EBY100/pYD1-EgM123有明顯綠色熒光，EBY100/pYD1未出現綠色熒光，說明EgM123蛋白定位表達在釀酒酵母的表面。

2.5 小鼠抗體水平變化

用ELISA法檢測試驗小鼠體內特異抗體水平變化，結果如圖5A～C所示，免疫15、30 d EBY100/pYD1-EgM123疫苗組血清特異性IgG、IgM抗體和糞便特異性IgA抗體的分泌均高于PBS組、EBY100組及EBY100/pYD1組。與PBS組相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗組在15 d時血清特異IgM、糞便特異IgA抗體分泌水平就已經極其顯著增強（P＜0.001），而血清特異IgG無顯著變化（P＞0.05）；在30 d時，血清特異IgG抗體分泌水平極顯著增強（P＜0.01）。與EBY100組相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗組在15 d時，血清特異IgG抗體分泌水平顯著增強（P＜0.05），糞便特異IgA抗體分泌水平極顯著增強（P＜0.01），血清特異IgM抗體分泌水平極其顯著增強（P＜0.001）；30 d時血清特異IgG抗體分泌水平依舊顯著增強（P＜0.05），而血清特異IgM、糞便特異IgA分泌水平極其顯著增強（P＜0.001）。

2.6 小鼠血清內細胞因子變化

小鼠細胞因子IL-5 ELISA試驗結果如圖6A所示，15、30 d各組相比IL-5分泌皆無顯著差異變化（P＞0.05）。小鼠細胞因子IL-17 水平ELISA檢測結果如圖6B所示，與PBS組、EBY100組及EBY100/pYD1組相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗組在15 d時IL-17分泌水平極其顯著增強（P＜0.001）；30 d時，依舊如此。小鼠細胞因子IFN-γ ELISA檢測結果如圖6C所示，與PBS組相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗組在15 d時IFN-γ分泌水平極其顯著增強（P＜0.001）；30 d時，與PBS組、EBY100組及EBY100/pYD1組相比，IFN-γ分泌水平極其顯著增強（P＜0.001）。

2.7 不同免疫方案對小鼠抗體的影響

2.7.1 不同免疫方案對血清IgG的影響

為了探索最佳免疫方案，分別用Regimen 1、Regimen 2、Regimen 3三種免疫方案對SPF級的BALB/c小鼠進行灌胃免疫。

在Regimen 1免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgG抗體在OD 450 nm的吸收值分別為2.47±0.19、2.47±0.14、2.40±0.16、2.97±0.17，加強免疫后，分別為2.46±0.22、2.57±0.42、2.83±0.28、3.41±0.16（圖7A）。分析結果顯示，采用Regimen 1免疫方案后，在免疫15 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgG抗體水平顯著高于PBS組、EBY100組和EBY100/pYD1組；在免疫30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgG抗體水平顯著高于PBS組和EBY100組。

在Regimen 2免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgG抗體在OD 450 nm的吸收值分別為2.43±0.18、2.24±0.18、2.25±0.21、2.73±0.05，加強免疫后，分別為2.44±0.19、2.58±0.45、2.54±0.08、3.46±0.27（圖7B）。分析結果顯示，采用Regimen 2免疫方案后，在免疫15 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgG抗體水平顯著高于EBY100組和EBY100/pYD1組；在免疫30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgG抗體水平顯著高于PBS組、EBY100組和EBY100/pYD1組。

在Regimen 3免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgG抗體在OD 450 "nm的吸收值分別為2.21±0.18、2.03±0.18、2.11±0.21、2.59±0.05，加強免疫后，分別為2.22±0.19、2.36±0.45、2.35±0.08、3.32±0.26，見圖7C。分析結果顯示，采用Regimen 3免疫方案后，在免疫15 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgG抗體水平顯著高于EBY100組和EBY100/pYD1組；在免疫30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgG抗體水平顯著高于PBS組、EBY100組和EBY100/pYD1組。

2.7.2 不同免疫方案對血清IgM的影響

在Regimen 1免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgM抗體在OD 450nm的吸收值分別為1.24±0.02、1.35±0.07、1.34±0.02、1.78±0.13，加強免疫后，分別為1.37±0.06、1.77±0.007、1.58±0.099、2.52±0.184（圖8A）。分析結果顯示，采用Regimen 1免疫方案后，在免疫15和30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgM抗體水平均顯著高于PBS組、EBY100組和EBY100/pYD1組。

在Regimen 2免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgM抗體在OD 450 nm的吸收值分別為1.14±0.12、1.39±0.02、1.38±0.04、1.84±0.05，加強免疫后，分別為1.65±0.33、1.80±0.04、1.55±0.05、2.46±0.28（圖8B）。分析結果顯示，采用Regimen 2免疫方案后，在免疫15 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgM抗體水平顯著高于PBS組、EBY100組和EBY100/pYD1組；在免疫30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgM抗體水平顯著高于EBY100/pYD1組。

在Regimen 3免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgM抗體在OD 450nm的吸收值分別為1.14±0.13、1.35±0.04、1.37±0.05、1.65±0.2 加強免疫后，分別為1.71±0.25、1.79±0.06、1.74±0.22、2.54±0.39（圖8C）。分析結果顯示，采用Regimen 3免疫方案后，EBY100/pYD1-EgM123組的IgM抗體水平隨免疫時間逐漸上升，但和其它試驗組對照組相比，無顯著差異。

2.7.3 不同免疫方案對糞便IgA的影響

在Regimen 1免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgA抗體在OD 450nm的吸收值分別為2.20±0.04、2.67±0.06、2.52±0.06、2.89±0.03，加強免疫后，分別為2.47±0.04、2.81±0.11、2.95±0.21、4.30±0.07（圖9A）。分析結果顯示，采用Regimen 1免疫方案后，在免疫15、30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgA抗體水平均顯著高于其PBS組、EBY100組和EBY100/pYD1組。

在Regimen 2免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgA抗體在OD 450 nm的吸收值分別為2.19±0.06、2.63±0.12、2.68±0.28、2.69±0.3 加強免疫后，分別為2.58±0.12、3.08±0.49、3.15±0.07、4.86±0.71（圖9B）。分析結果顯示，采用Regimen 2免疫方案后，在免疫15 d后，各試驗組間無顯著差異；免疫30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgA抗體水平顯著高于PBS組，但與EBY100組和EBY100/pYD1組無顯著差異。

在Regimen 3免疫方案下，首次免疫后15 d，PBS組、EBY100組、EBY100/pYD1組和EBY100/pYD1-EgM123組的IgA抗體在OD 450nm的吸收值分別為2.19±0.05、2.60±0.09、2.73±0.22、2.60±0.20，加強免疫后，分別為2.62±0.06、3.19±0.33、3.04±0.23、5.50±0.20（圖9C）。分析結果顯示，采用Regimen 3免疫方案后，在免疫15 d后，各試驗組間無顯著差異；免疫30 d后，EBY100/pYD1-EgM123疫苗免疫組的IgA抗體水平顯著高于PBS組，EBY100組和EBY100/pYD1組。

3 討 論

酵母菌（yeast）被廣泛應用于食品工業^［19］，是一種直徑達到10 μm的單細胞真核生物，具有翻譯后再修飾的能力，并且酵母通過了美國食品藥品監督管理局（FDA）的GRAS認證，可以保證其生物安全性^［20］。酵母菌的細胞壁可以保護抗原通過胃腸道，正因為酵母的疫苗傳遞系統有以上特點，所以其非常適合用于口服疫苗的開發^［21］。但是這一系統也有缺點，主要是重組蛋白的高糖基化^［22］。不過針對這個問題，已經有研究生產出有缺陷的N-糖基化酵母菌株來解決這個問題^［23］。以酵母為基礎的全細胞疫苗也因其引發免疫反應的能力而被廣泛研究。釀酒酵母是酵母菌的代表菌種之一，其表面展示系統也最為完善。

pYD1質粒可以穿梭于E.coil DH5α與釀酒酵母EBY100之間。篩選E.coil DH5α/pYD1-EgM123陽性克隆時需要使用Amp篩選培養基，構建EBY100/pYD1-EgM123后進行陽性篩選時需要使用色氨酸營養缺失型篩選培養基，因為帶有目的基因的pYD1整合到EBY100的基因組時抗性標記便隨即丟失^［24］。

本研究對構建的表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123經過半乳糖誘導后進行體外分析。以EBY100/pYD1作為陰性對照，通過Western blot對誘導后，盡管在EBY100/pYD1-EgM123 檢測到一條約31.78 ku的特異性條帶，但是Western blot不能充分證實表面展示型重組釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123將EgM123蛋白展示在釀酒酵母菌表面。通過免疫熒光試驗檢測到釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123表面有特異綠色熒光產生，結果充分證明EgM123蛋白展示在釀酒酵母菌表面。

本研究選擇 SPF 級 BALB/c 小鼠作為研究細粒棘球絳蟲口服疫苗的動物模型，通過 ELISA 檢測口服疫苗誘導的特異性的IgG、 IgA和IgM 抗體應答，通過結果可發現小鼠血清中的抗體水平可以隨著免疫次數增加而上升，其中IgA升高水平尤為顯著。這與Wang等^［25］利用釀酒酵母表面表達弓形蟲TgMIC16蛋白研制弓形蟲pCTCON2-TgMIC16/EBY100口服疫苗免疫效果部分試驗結果相似。這些結果表明EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母口服疫苗載體可誘導小鼠產生特異性抗體，具有較好的免疫保護作用。

分泌型 IgA 是黏膜免疫應答的特征性抗體。通過黏膜途徑（口服免疫）誘導的分泌型 IgA 在胃黏膜表面形成重要的免疫保護層，構成生物屏障進而防止細菌進入黏膜。分泌型IgA不能通過經典途徑活化補體，也沒有調理素的作用，所以不會引起炎癥反應。因此，分泌型IgA可以阻止微生物滲透到黏膜但不會引起腸道黏膜較脆弱的組織產生炎癥損傷，這對于腸道抵御病原體感染非常有利。本研究通過 ELISA 檢測糞便中特異性分泌型IgA，表明EBY100/pYD1-EgM123能誘導特異性分泌型IgA 抗體應答。結果與黃子恩^［26］構建的表面展示型釀酒酵母表達載體EBY100/pYD1-Envelope口服免疫小鼠產生分泌型IgA抗體的部分結果一致。

在包蟲病中，宿主在感染細粒棘球絳蟲后以兩種免疫反應為主^［27］：Th1型和Th2型，Th1型能夠抑制蟲體發育生長、降低蟲體在宿主體內致病作用；Th2型介導體液反應，起免疫抑制作用。Th1型和Th2型免疫反應之間相互制衡。而正常的腸道固有層中可以檢測到屬于CD4 T 細胞的三個主要功能性亞群：Th1、Th2、Th17。其中Th17亞群可產生IL-17和IL-2 可促進表達這兩類細胞因子受體的腸道上皮細胞加速分泌黏液和β-防御素，具有保護黏膜作用^［28］。本研究分別測定了Th1、Th2及Th17型的細胞因子，結果發現EBY100/pYD1-EgM123組對小鼠細胞因子IL-17、IFN-γ的分泌量顯著加強（P＜0.001），提示EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株在小鼠體內成功誘導了Th17型、Th1型免疫。

表面展示型釀酒酵母口服疫苗載體具有較好的免疫保護作用。口服遞送的表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-EgM123除了能夠誘導機體產生黏膜免疫應答之外，還可以誘導體液免疫。鑒于口服免疫需要的劑量較高，在給藥總劑量一定的條件下，本試驗參考了黃子恩^［26］表面展示型釀酒酵母表達載體EBY100/pYD1-Envelope的免疫劑量，評估了三個不同免疫時間、及不同免疫劑量對免疫效果的影響。試驗證明，當運用 Regimen 3 方案免疫時，在EBY100/pYD1-EgM123中檢測到血清特異IgM 抗體效價和糞便特異 IgA 抗體水平最高，即最優免疫方案是 Regimen 3。單次免疫后，試驗組糞便特異 IgA 抗體水平顯著高于空白對照組和免疫對照組（Plt;0.05），表明EBY100/pYD1-EgM123僅單次免疫就能誘發黏膜免疫應答（糞便IgA）。初次免疫 15 d后，以同樣免疫方案加強一次免疫，檢測到試驗組血清特異 IgG、IgM 抗體效價顯著升高，且與空白對照組和免疫對照組存在顯著性差異 （Plt;0.05），表明EBY100/pYD1-EgM123需要經過加強免疫才能誘發有意義的體液免疫應答（血清 IgG 和 IgM）。

4 結 論

本試驗成功構建了細粒棘球絳蟲EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株，并對其免疫原性進行了初步驗證。試驗結果表明，EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株可誘導宿主產生特異的IgG、IgM和IgA 抗體，并可顯著提升宿主IL-17和IFN-γ的表達水平。同時，本試驗優化了EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株的免疫方案。這些試驗數據為進一步將EBY100/pYD1-EgM123表面展示型釀酒酵母菌株作為細粒棘球絳蟲終末宿主候選疫苗，開展免疫保護試驗提供了理論依據。

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（編輯 白永平）