牛種布魯氏菌MgtC蛋白在抵抗低Mg2+環境中的生物學功能研究

摘 要： MgtC蛋白在多種胞內寄生菌中是一個重要的毒力因子并表現出抵抗低Mg²⁺環境的能力。布魯氏菌是一種重要的胞內寄生菌，但是關于MgtC蛋白在布魯氏菌中的生物學功能報道較少。為了全面闡述MgtC在布魯氏菌中的生物學特性，本文研究了牛種布魯氏菌MgtC蛋白對低Mg²⁺環境的適應性及其它可能的生物學功能。構建牛種布魯氏菌（S2308株）的mgtC基因缺失突變株S2308ΔmgtC，同時采用質?；匮a方式構建回補株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC），隨后對其開展低/高Mg²⁺環境中生長曲線測定，ATP含量測定，胞內存活，環境應激，生物被膜檢測和小鼠攻毒試驗等研究，全面分析MgtC在牛種布魯氏菌中的生物學功能。結果顯示：成功構建缺失株S2308ΔmgtC及其回補株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）。牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環境中，mgtC基因轉錄水平顯著上調（Plt;0.05）；與親本株和回補菌株相比，缺失株S2308ΔmgtC在低Mg²⁺環境中的生長曲線（Plt;0.001）、膜結構完整性（Plt;0.05）、生物被膜形成能力（Plt;0.01）均低于與親本菌株和回補菌株，而菌體內ATP含量均高于親本菌株和回補菌株（Plt;0.001）。此外，mgtC基因的缺失不影響牛種布魯氏菌在巨噬細胞內的存活以及對小鼠的致病能力。在低Mg²⁺環境下，牛種布魯氏菌通過MgtC保證細菌ATP正常水解，維持自身正常生理活動和膜結構的完整性，但是MgtC對牛種布魯氏菌的毒力和致病性無明顯影響，本研究為深入了解牛種布魯氏菌提供了數據支撐。

關鍵詞： 牛種布魯氏菌S2308；mgtC；低Mg²⁺環境；生物學功能

中圖分類號： S852.614"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0365-13

收稿日期：2024-02-28

基金項目：中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項 （2023-YWF-ZYSQ-05）；“十四五”國家重點研發計劃 （2023YFD1800703）；中國農業科學院科技創新工程項目（CAAS-CSLPDCP-202403）;感謝中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項 （2023-YWF-ZYSQ-05）、十四五國家重點研發計劃 （2023YFD1800703）以及中國農業科學院科技創新工程項目（CAAS-CSLPDCP-202403）對本研究的支持

作者簡介：王恒泰（1998-），男，山東滕州人，碩士生，主要從事布魯氏菌抵抗吞噬溶酶體不良環境的研究，E-mail：17861509833@163.com

*通信作者：李 朋，主要從事布魯氏菌病防控及其致病機制研究，E-mail： lipeng01@caas.cn;丁家波，主要從事人畜共患病及其防控研究，E-mail： dingjiabo@caas.cn

Biological Function of MgtC Protein in Brucella abortus to Low-Mg²⁺ Resistant Environment

WANG" Hengtai L Lang JIANG" Hui CHENG" Junsheng2， LIU" Minghe2，

CHU" Yuefeng3， XU" Jian3， LI" Peng "DING" Jiabo^1*

（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Chinese Academy of Agricultural

Science， Beijing 100193，" China;

2.China Veterinary Drug Supervision Institute，

Beijing 10008" China;

3.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention，

College of Veterinary Medicine， Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research

Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou 730000，" China）

Abstract： "MgtC protein is an important virulence factor in a variety of intracellular parasites and possesses ability of resistance to low Mg²⁺ environment. Brucella is an important intracellular parasite， and there are few reports on the biological function of MgtC protein in Brucella. To explore the biological characteristics of MgtC in Brucella abortus， the adaptability to low Mg²⁺ environment and other possible biological functions were studied in this study. Brucella abortus S2308 mgtC deletion mutant （S2308ΔmgtC） and the complementary strain S2308ΔmgtC （pBBR1MCS-mgtC） were constructed. Subsequently， studies on the three strains in low/high Mg²⁺ environment with growth curve determination， ATP content determination， intracellular survival， environmental stress， biofilm detection and mouse challenge test were conducted to comprehensively analyze the biological function of MgtC in Brucella abortus. The deletion strain S2308ΔmgtC and its complementary strain S2308ΔmgtC （pBBR1MCS-mgtC） were successfully constructed. In Brucella abortus S2308， expression of mgtC gene was significantly up-regulated in low Mg²⁺ environment（Plt;0.05）. The growth curve（Plt;0.001）， membrane structure integrity（Plt;0.05）and biofilm formation ability（Plt;0.01）of S2308ΔmgtC in low Mg²⁺ environment were lower than those of the parent strain and the complementary strain， while the ATP content in the strain was higher than that of the parent strain and the complementary strain（Plt;0.001）. In addition， the deletion of mgtC gene did not affect the survival of Brucella abortus to macrophages and the pathogenicity of mice. In low Mg²⁺ environment， Brucella abortus employed MgtC to ensure the normal hydrolysis of ATP and maintain its normal physiological activities and the integrity of membrane structure. However， MgtC had no significant effect on the virulence and pathogenicity of Brucella abortus. This study provides data support for further understanding of Brucella abortus.

Key words： Brucella abortus S2308; mgtC; low Mg²⁺ environment; biological function

*Corresponding authors：" LI Peng， E-mail： lipeng01@caas.cn; DING Jiabo， E-mail： dingjiabo@caas.cn

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡稱布病，是一種由布魯氏菌（Brucella spp.）引起重要人獸共患細菌病，嚴重影響畜牧業發展及人類健康。世界衛生組織（WHO）將布病劃定為對全球公共衛生安全具有嚴重危害且最容易被忽視的人獸共患病之一^［1］。布魯氏菌屬革蘭陰性菌，是一種兼性胞內寄生菌，缺乏眾所周知的經典毒力因子，如孢子、菌毛、鞭毛、溶細胞素、外毒素、分泌蛋白酶和毒力質粒^［2］等，其毒力主要體現在感染宿主細胞并在胞內復制的能力。布魯氏菌既可以感染巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞等專職吞噬細胞，也可以感染胎盤滋養層細胞、上皮細胞等非專職吞噬細胞^［3］。據報道，布魯氏菌感染宿主細胞和胞內存活所必需的毒力因子主要包括環β- 形成布氏小體（BCV）^［5］，在多種毒力因子以及其他相關因子的作用下，適應宿主內各種壓力環境（如酸性環境、低營養環境及低Mg²⁺環境等），實現抵抗宿主吞噬溶酶體的殺傷作用，從而保證布魯氏菌在宿主細胞內建立感染并進行胞內復制。但是，布魯氏菌如何適應低Mg²⁺環境目前還不清楚。

微生物在執行其生物功能時通常需要金屬陽離子的參與，其中鎂離子（Mg²⁺）在活細胞中含量最多，濃度范圍為5～20 mmol·L^{-1 ［6］}。Mg²⁺具有最小的離子半徑^［7］和最大的水合半徑^［8］，因此經常能夠偶聯其他化合物輔助其發揮功能。Mg²⁺是促進核糖體的組裝^［9］、維持RNA和DNA的穩定^［10］，參與生物體各項重要酶促反應^［11］，中和外膜脂多糖（LPS）中的負電荷^［12］等生物學過程所必需的金屬離子。此外，Mg²⁺是一種細胞外信號，控制細菌的PhoP/PhoQ雙組分調節系統^［13］。在Mg²⁺匱乏環境中，許多因子的表達被PhoP/PhoQ雙組分調節系統直接激活^［14］，包括Mg²⁺轉運蛋白MgtA和MgtB^［15］、修飾LPS的酶、F1Fo ATP合酶抑制蛋白MgtC^［16］和多胺^［17］。

研究顯示，沙門菌、結核分枝桿菌、耶爾森菌等胞內寄生菌都需要MgtC蛋白以保證其在巨噬細胞內存活和在低Mg²⁺培養基中生長^［18］，但是對于同為胞內寄生菌的布魯氏菌，其MgtC蛋白的生物學功能報道較少。2005年，Lavigne等^［19］報道豬種布魯氏菌的胞內復制需要MgtC的參與，但是MgtC蛋白具體的作用機制、對低Mg²⁺環境的適應性及其它可能的生物學功能仍不清楚。為了進一步全面闡明布魯氏菌MgtC蛋白的生物學功能，本研究以牛種布魯氏菌MgtC為研究對象，探究在低Mg²⁺環境下MgtC對牛種布魯氏菌的生長情況、對ATP水解供能的影響，以及在酸性應激、氧化還原應激、生物被膜形成、胞內存活和小鼠致病性等方面發揮的生物學功能，為闡明牛種布魯氏菌的致病機制提供理論數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

牛種布魯氏菌S2308株（Brucella abortus S2308）由中國獸醫藥品監察所檢測技術室保存并提供，pUCML-secB、pBBR1MCS-1等載體由本實驗室保存。凡涉及強毒株操作均在中國獸醫藥品監察所P3實驗室中完成。

1.1.2 主要試劑和儀器

胰酪大豆胨液體/固體培養基（Trypticasesoy Broth/Agar，TSB/TSA）購自北京強欣博瑞有限公司，Primer star DNA聚合酶購自北京TaKaRa生物技術有限公司，DNA Marker購自北京康潤生物，限制性核酸內切酶購自NEB生物公司，DNA純化試劑盒購自Omega生物公司，質粒小提中量試劑盒、細菌RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，TritonX-100、多黏菌素B（polymyxin B）、30%過氧化氫（H 2O 2）、NaCl、硝酸鈉、M9低鹽培養基、ATP檢測試劑盒等購自上海索萊寶生物科技有限公司，反轉錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，染色法熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2×Taq Master Mix酶購自諾唯贊生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌RNA提取

牛種布魯氏菌S2308株稀釋至1×108 CFU·mL^- 然后在添加0.1% 酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、10 μmol·L^-1或10 mmol·L^-1 MgCl 2的M9^［19］培養基中加入50 μL稀釋好的菌液，37℃，220 r·min^- 搖至OD 600 nm=0.4～0.6，按照Tian Gen RNA prep Pure cell/Bacteria total RNA extraction kit（DP430）提取RNA，每個樣品設3個重復。

1.2.2 熒光定量qPCR

取上述提取出的RNA 1 μg，用東洋紡反轉錄試劑盒進行去除模板DNA，并進行反轉錄。反轉錄1 μL當模板，用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行染料法qPCR的測定，以16S為內參，2^-ΔΔCt方法計算，每個試驗組做3個重復。

1.2.3 引物設計

根據NCBI網站上公布的牛種布魯氏菌S2308株全基因組序列（GenBank登錄號為NC_007624.1）和pBBR1MCS-1載體的基因序列（GenBank登錄號為U02374.1），用Snap gene軟件分別設計擴增引物，引物序列見表1。

1.2.4 牛種布魯氏菌mgtC缺失株及其回補株的構建

通過PCR擴增mgtC（BAB_RS26555）的上下游同源臂，連接到pUCML-secB載體中，獲得相應重組質粒。將鑒定成功后的自殺質粒電轉到牛種布魯氏菌S2308感受態中，涂布于含有卡那霉素抗性基因的TSA板。挑取單菌落搖混稀釋后涂布于含5%蔗糖的TSA板上。挑取單菌落分別在卡那霉素抗性和5%蔗糖TSA板進行劃線，選擇在卡那霉素板上不能生長而在蔗糖板上生長的單菌落進行PCR鑒定；通過PCR擴增含有自身啟動子的mgtC（BAB_RS26555）基因，純化后與回補質粒pBBR1MCS-1連接，篩選正確的重組質粒。將質粒電轉至S2308ΔmgtC感受態中，涂布到含有氯霉素的TSA板上，放到37℃、5% CO 2培養箱72 h，挑取單菌落進行鑒定。

1.2.5 生長曲線的測定

將S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）菌株在3 mL TSB中培養24 h。取1 mL離心后，用1 mL M9培養基重懸，稀釋至1×108 CFU·mL^- 加入至20 mL含有0.1%酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、1%阿拉伯糖、10 μmol·L^-1或10 mmol·L^-1 MgCl 2的M9培養基中，每12h測一次OD 600 nm吸光度。

1.2.6 RNA-Sequencing和RNA-Seq分析" 對菌株S2308、S2308ΔmgtC分別進行高/低Mg²⁺誘導，提取RNA，進行轉錄組測序。基于CRAC輸出，使用DESeq對每個物種的兩種不同誘導條件進行歸一化和差異基因表達分析。

1.2.7 細菌內ATP含量試劑盒

將菌株S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC），初始菌落數稀釋至1×108 CFU·mL^-1。然后在添加0.1%酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、1%阿拉伯糖、10 μmol·L^-1或10 mmol·L^-1 MgCl 2的M9培養基中加入50 μL稀釋好的菌液，在37 ℃、220 r·min^-1下培養至OD 600 "nm=0.4～0.6。對上述菌液計數后，按照索萊寶ATP檢測試劑盒（貨號：BC0305）進行測定。

1.2.8 環境壓力應激

測定各菌株對酸性環境的敏感性，將各菌株稀釋至1×108 CFU·mL^- 取10 μL加入200 μL pH=5.5或者pH=4.5的TSB中^［20］，37℃孵育2 h，取100 μL進行稀釋計數，計算存活率。

采用H 2O 2測定牛種布魯氏菌對氧化應激的敏感性，將菌株稀釋至1×106 CFU·mL^- 在菌懸液中添加H 2O "最終濃度分別為2.5 mmol·L^-1和5 mmol·L^-1［20］。37℃、孵育2 h后，取100 μL進行稀釋計數，計算存活率。

為了確定每個菌株突變體對熱或冷沖擊脅迫的敏感性，將5 μL梯度稀釋的細菌培養物（1×108 CFU·mL^-1）在42或25℃、5% CO 2的TSA培養基上培養72 h。

為了比較各菌株在低鐵培養基中的生長情況，在TSA培養基中加入0.4 mmol·L^-1濃度的鐵螯合劑2， 2-聯吡啶^［21］（bipyridine），模擬缺鐵環境。各菌株培養至指數期，連續稀釋計數至1×108 CFU·mL^-1。經倍比稀釋后，將5 μL滴于含有0.4 mmol·L^-1的2，2-聯吡啶的TSA上，37℃孵育72 h。

1.2.9 陽離子殺菌肽的敏感性

將終濃度為1 mg·mL^{-1 ［22］}的多黏菌素B加入菌懸液（1×108 CFU·mL^-1）中，37℃孵育2 h。通過稀釋計數計算存活率。

1.2.10 對硝普鈉（SNP）的敏感性

SNP是一種自發釋放NO的有機物質。細菌通常采用多種策略來處理NO的毒性作用。SNP用于評估對亞硝化脅迫的敏感性。各菌株先培養至指數期，連續稀釋計數至1×108 CFU·mL^- 取5 μL連續倍比稀釋10倍，滴在含有0.5 mmol·L^-1SNP的TSA^［22］，37℃孵育72 h。無SNP的TSA作為正常生長對照。

1.2.11 生物被膜的形成能力

將各菌株用TSB調整菌液濃度為1×107 CFU·mL^- 進行生物被膜形成測定，操作步驟：向96孔板中每孔接種200 μL提前制備的菌液，再設置一組空白對照（僅加入200 μL TSB培養液），置于37℃、5%CO 2培養箱中培養；在培養的48、96 h取出96孔板，棄掉TSB培養液，加入300 μL PBS輕柔地洗滌3次，除去浮游菌體，向每孔加入200 μL甲醇，自然干燥；加入200 μL 0.1%結晶紫溶液染色20 min，用300 μL PBS輕柔地清洗3次，自然風干；加入200 μL提前配制的95%乙醇溶解結晶紫染料，充分溶解后置于酶標儀中檢測595 nm處吸光度。

1.2.12 胞內存活

RAW264.7細胞用含有1%血清的DMEM稀釋至2.5×105 CFU·mL^- 并在24孔板中培養12 h（Corning， NY， USA）。按MOI=100將各菌株分別感染細胞，1 000 g離心5 min，孵育1 h。感染完后，PBS洗滌細胞3次，并加入慶大霉素（50 μg·mL^-1）的DMEM殺菌1 h。感染后（p.i.）1、12、24、48、72 h，用500 μL 0.1%TritonX-100水溶液裂解細胞，用PBS倍比稀釋滴板計數。試驗一式三次，至少重復兩次。

1.2.13 小鼠毒力試驗

9只6周齡BALB/c小鼠，購自維通利華公司，平均分為S2308組、S2308Δmgtc組和S2308Δmgtc（PBBR1MCS-1）組。

將各菌株稀釋成1×107 CFU·mL^- 分別吸取100 μL（1×106 CFU·mL^-1）對各組小鼠進行腹腔注射。在攻毒后2、4、6周處死小鼠，無菌采集小鼠脾，加1 mL生理鹽水研磨脾組織；連續倍比稀釋后，涂布無抗的TSA平板，置于37℃、5%CO 2培養箱中培養72 h，計算脾細菌載量。試驗中涉及的小鼠試驗的操作均在中國獸醫藥品監察所P3實驗室中完成。倫理審查批件CIVDC2019-000672。

1.2.14 數據統計分析

所有數據采用“平均數±標準差（±s）”表示，用 Graph Pad Prism 8統計學軟件進行數據的差異顯著性分析（t 檢驗法，*. Plt;0.05， **. Plt;0.0 ***. Plt;0.001）。

2 結 果

2.1 牛種布魯氏菌mgtC缺失株及其回補株的構建及其轉錄水平檢測

為探究MgtC在牛種布魯氏菌S2308中的生物學功能，設計引物擴增了mgtC上下游同源臂并連接到自殺質粒，PCR鑒定結果顯示，正確連接的質粒擴增出大小為2 000 bp的條帶（圖1A），表明mgtC自殺質粒構建成功。隨后，將自殺質粒電轉進入牛種布魯氏菌S2308，PCR鑒定結果顯示，親本株S2308擴增出2 717 bp的條帶，而缺失株S2308ΔmgtC擴增出2 000 bp的條帶（圖1B），表明mgtC基因的缺失株構建成功。

同時，設計引物擴增出含自身啟動子的mgtC基因序列，隨后連接至過表達質粒，PCR鑒定結果顯示能擴增出大小為917 bp的條帶（圖1C），表明mgtC過表達質粒構建成功。隨后，將自殺質粒電轉進入缺失株S2308ΔmgtC，PCR鑒定結果顯示，菌株擴增出大小為917 bp的條帶（圖1D），表明mgtC基因的回補菌株構建成功。

為驗證mgtC基因在缺失株和回復株中的轉錄水平，熒光定量PCR檢測牛種布魯氏菌S2308株、S2308ΔmgtC和回補菌株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）中的mgtC基因的轉錄水平，結果顯示：與親本株S2308相比，缺失株S2308ΔmgtC的mgtC基因未轉錄，回補菌株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）中的mgtC基因的轉錄水平約為親本株轉錄水平的80%，表明mgtC基因的缺失株和回復株構建成功（圖1E）。

2.2 MgtC是牛種布魯氏菌S2308應對低Mg²⁺環境的關鍵基因

為探究Mg²⁺對牛種布魯氏菌S2308生長代謝的影響，測定了牛種布魯氏菌S2308在高/低Mg²⁺環境中的生長曲線。結果發現：牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環境中的生長速度明顯低于在高Mg²⁺環境中的生長速度（Plt;0.00 圖2 A）。牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環境中誘導4、12、24 h后，對菌液進行稀釋計數，結果發現：與高Mg²⁺環境相比，親本菌株在低Mg²⁺環境下細菌CFU顯著降低（Plt;0.00 圖2 B）。綜上所述，Mg²⁺對牛種布魯氏菌S2308生長代謝必不可少。

為探究MgtC對牛種布魯氏菌S2308適應低Mg²⁺環境的影響，首先利用qPCR方法檢測牛種布魯氏菌S2308的mgtC基因在低Mg²⁺環境中的轉錄水平。結果顯示：與高Mg²⁺環境相比，mgtC在低Mg²⁺環境中誘導4、12、24 h后，其轉錄水平均顯著上調（Plt;0.05或Plt;0.01），并在低Mg²⁺環境中誘導12 h后，轉錄水平最高（Plt;0.0 圖2 C）。隨后，測定了牛種布魯氏菌S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）在高/低Mg²⁺環境中的生長曲線。結果發現：在高Mg²⁺環境中，三株菌株在生長速度上均沒有明顯差異（Pgt;0.05，圖2 D）;在低Mg²⁺環境中，S2308ΔmgtC的生長速度明顯小于親本及回補菌株（Plt;0.0 圖2 E）。因此，mgtC基因是牛種布魯氏菌S2308應對低Mg²⁺環境的關鍵基因。

2.3 MgtC通過維持菌體ATP的正常水解供能來影響牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環境中生長代謝

為探討MgtC在低Mg²⁺環境中影響牛種布魯氏菌生長代謝的機制，分別提取在低Mg²⁺環境下誘導的S2308、S2308ΔmgtC的RNA，隨后進行轉錄組分析。結果發現：與親本株S2308相比，在低Mg²⁺環境中S2308ΔmgtC的糖ABC轉運蛋白底物結合蛋白（sugar ABC transporter substrate-binding protein）顯著上調，磷酸腺苷蛋白（ATP-binding protein）顯著下調，其他基因（包括毒力基因等）的表達差異不顯著（圖3A、B）。將差異基因進行GO分析，發現差異基因大都與本身組分有關（圖3C）。綜上所述，在低Mg²⁺環境中牛種布魯氏菌MgtC可能主要參與糖蛋白的轉運和調控菌內ATP水解供能的過程。

上述研究證明，MgtC對于牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環境下的生長至關重要，并且其主要可能參與菌內ATP水解供能的調控。為驗證上述猜想，分別檢測S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）三株菌株中在高/低Mg²⁺環境中ATP的含量。發現在高Mg²⁺環境中，S2308ΔmgtC的ATP含量與親本株和回補株無顯著差異（圖3D）；而在低Mg²⁺環境中，S2308ΔmgtC菌株的ATP含量明顯高于親本和回補株（圖3D），說明缺失株在低Mg²⁺環境中菌體內的ATP無法被催化釋放能量。綜上所述，說明mgtC不僅是牛種布魯氏菌抵抗低Mg²⁺環境的重要基因，同時也是催化ATP釋放能量以保證細菌維持正常生長代謝的重要基因。

2.4 MgtC參與牛種布魯氏菌抵抗氧化應激

為了探究牛種布魯氏菌S2308中MgtC在抵抗吞噬溶酶體內部應激環境中發揮的重要作用，作者模擬了相應的壓力環境，分別檢測了S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）在不同壓力環境中的存活率。

分別使用終濃度為5.0和2.5 mmol·L^-1的過氧化氫來評估牛種布魯氏菌抵抗氧化應激的能力。結果發現：與親本和回補株相比，缺失株S2308ΔmgtC在濃度為5.0和2.5 mmol·L^-1的過氧化氫環境中的存活率顯著降低，表明 MgtC有助于牛種布魯氏菌抵抗氧化應激環境（圖4 A）。

另外，使用pH=5.5和pH=4.5的TSB、25℃培養箱、42℃培養箱、0.4 mmol·L^-1鐵螯合劑（2-2聯吡啶）、0.5 mmol·L^-1硝普鈉分別模擬了酸性環境、極端溫度環境、低鐵壓力環境、亞硝化壓力環境，評估牛種布魯氏菌在這些壓力環境中的存活能力，結果發現：S2308ΔmgtC在酸性環境、極端溫度環境、低鐵壓力環境、亞硝化壓力環境中的存活能力與親本株和回復株沒有顯著差異，表明MgtC對于牛種布魯氏菌抵抗上述壓力環境無關（圖4B、4C）。

2.5 牛種布魯氏菌利用MgtC抵抗陽離子殺菌肽的殺傷

使用終濃度為1 mg·mL^-1多黏菌素B模擬抵抗殺菌因子環境，評估牛種布魯氏菌的抗菌肽耐受性。結果發現：與親本株和回復株相比，S2308ΔmgtC在濃度為1 mg·mL^-1多黏菌素B環境中存活率明顯降低（圖5），表明 MgtC參與布魯氏菌抵抗陽離子殺菌肽的殺傷。

2.6 MgtC參與牛種布魯氏菌生物被膜的形成

生物被膜（biofilm， BF）作為病原菌抵御藥物和免疫系統殺傷的有效物理屏障，對細菌的生長具有重要意義。因此，測定了牛種布魯氏菌生物被膜的形成能力。結果發現：再培養48 h后，S2308ΔmgtC的生物被膜形成能力與親本和回補株并無顯著差異；在培養96 h后，S2308ΔmgtC的生物被膜形成能力顯著低于親本和回補株，表明 MgtC參與了牛種布魯氏菌生物被膜的形成（圖6）。

2.7 MgtC不影響牛種布魯氏菌的胞內存活能力和對小鼠的致病性

為了探究MgtC對于牛種布魯氏菌毒力的影響，分別用巨噬細胞和小鼠模型進行毒力評估。分別用S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）感染巨噬細胞RAW264.7，結果發現：在感染1、4、24、48、96 h后，S2308ΔmgtC的胞內存活的CFU與親本株和回復株沒有顯著差異（圖7A），表明MgtC與牛種布魯氏菌的胞內存活能力無關。隨后建立的BALB/c小鼠感染模型，分別以1×106 CFU·mL^-1的劑量感染小鼠，在感染2、4、6、8周后分別取脾進行定植量的測定，結果發現：在感染2、4、6、8周后，S2308ΔmgtC的脾載菌量與親本株和回復株沒有顯著差異（圖7 B），表明MgtC與牛種布魯氏菌對小鼠的致病性無關。

3 討 論

牛種布魯氏菌是一種胞內寄生菌，毒力主要體現于其胞內存活能力^［23］。牛種布魯氏菌入侵細胞后，形成布氏小體（BCV），通過多種因子協同作用幫助牛種布魯氏菌突破胞內多種壓力環境，如酸性環境、營養匱乏環境、低Mg²⁺環境等，使BCV移行至內質網進行復制^［24］。其中，MgtC是細菌適應低Mg²⁺環境的關鍵因子^［25］。據報道在沙門菌、結核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌等胞內寄生菌中，MgtC不僅有助于細菌適應低Mg²⁺環境，還能夠影響細菌的毒力^［26］。本研究成功構建了牛種布魯氏菌mgtC基因的缺失株用于探究牛種布魯氏菌MgtC的生物學功能（圖1A～E），為深入了解牛種布魯氏菌提供了數據支撐。

Mg²⁺是多種生物學過程所必需的金屬離子，也是Mg²⁺是一種細胞外信號^［27］。在Mg²⁺匱乏環境中，會直接激活許多因子的表達^［28］。本研究發現Mg²⁺對于牛種布魯氏菌S2308的生長代謝必不可少，牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺條件下生長速度明顯降低（圖2A、B），目前在其他胞內寄生菌上還沒有類似的報道。此外，本研究表明mgtC基因是牛種布魯氏菌S2308應對低Mg²⁺環境的關鍵基因（圖2D、E），S2308ΔmgtC在低Mg²⁺環境中生長速度顯著低于親本菌株，其結果與鼠疫耶爾森菌MgtC功能一致^［29］。但是牛種布魯氏菌mgtC基因其在低Mg²⁺環境中的轉錄水平呈現先上升后下降的趨勢（圖2C），暗示牛種布魯氏菌可能通過調控mgtC基因表達適應低Mg²⁺壓力應激環境。另外，Mg²⁺也是生物體各項酶促反應的最重要的輔因子^［30］，其中包括Mg²⁺與ATP之間相互作用。在生物體內Mg²⁺通常與ATP偶聯^［31］，是ATP水解成ADP并釋放能量這一過程中必不可少的重要金屬陽離子。本研究轉錄組表明，MgtC可能是通過影響ATP結合蛋白和ABC蛋白轉運系統從而影響牛種布魯氏菌在低Mg²⁺環境中的生長代謝（圖3A～C），之后通過測定牛種布魯氏菌在高/低Mg²⁺環境中菌體內ATP含量，證明了牛種布魯氏菌MgtC參與ATP正常水解釋放能量的過程（圖3D）。

結構預測分析發現，牛種布魯氏菌MgtC具有一個跨膜區域，說明其也可能參與維持牛種布魯氏菌膜結構穩定性。因H 2O 2 能夠通過膜定位的水通道蛋白進入胞內，進而使細胞遭受氧化應激^［32］，多黏菌素B常用來測定細菌外膜的穩定性并且生物被膜（biofilm， BF）可作為病原菌抵御不良環境的物理屏障，本研究模擬了相應的壓力應激條件，發現mgtC基因不僅參與牛種布魯氏菌抵抗氧化應激環境（圖4A），還參與牛種布魯氏菌抵抗陽離子殺菌肽的殺傷（圖4B）和生物被膜（圖4C）的形成。

MgtC在沙門菌、結核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌等胞內寄生菌中是一種重要的毒力因子^［33］，本研究發現牛種布魯氏菌MgtC不影響其胞內存活能力和對小鼠的致病性（圖5A、B），這與MgtC在其他胞內寄生菌（如沙門菌、結合分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌）中的功能不一致。究其原因可能有三點：1）牛種布魯氏菌MgtC可能與其他胞內寄生菌MgtC的同源性較低，導致MgtC對布魯氏菌的毒力影響異于對其他胞內寄生菌的毒力影響；2）在其他胞內寄生菌中，MgtC通過影響其重要毒力因子的表達導致其毒力降低^［34］，本研究轉錄組結果發現MgtC在低Mg²⁺環境中并不影響牛種布魯氏菌毒力基因的差異表達（圖3A、C），并且MgtC對于牛種布魯氏菌抵抗酸性環境并無影響（圖4D），這些結果支持了MgtC對牛種布魯氏菌的毒力影響不大；3）牛種布魯氏菌可能還存在MgtC以外的功能基因來代償性幫助牛種布魯氏菌抵抗低Mg²⁺環境，進而保證牛種布魯氏菌的胞內存活，這需要進一步的研究。值得一提的是，豬種布魯氏菌的胞內存活需要MgtC的^［19］，而牛種布魯氏菌MgtC不影響其胞內存活能力，這可能是由于不同種屬布魯氏菌之間存在種間差異。

4 結 論

本研究通過構建牛種布魯氏菌 S2308ΔmgtC基因缺失株，初步探討了MgtC在牛種布魯氏菌中的生物學功能。研究表明，在低Mg²⁺環境中MgtC維持細菌ATP正常水解釋放能量來維持自身正常生理活動，此外還參與維持細菌膜結構的完整性，幫助牛種布魯氏菌抵抗氧化應激、抵抗陽離子殺菌肽的殺傷，但是MgtC對牛種布魯氏菌的毒力沒有明顯影響。本研究為進一步揭示MgtC在牛種布魯氏菌中的功能和對布魯氏菌的致病作用提供了參考和方向，具有重要意義。

5 致 謝

感謝中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項 （2023-YWF-ZYSQ-05）、“十四五”國家重點研發計劃 （2023YFD1800703）以及中國農業科學院科技創新工程項目（CAAS-CSLPDCP-202403）對本研究的支持。

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（編輯 白永平）